老芒麦(Elymus sibiricus L.)基因组Survey及gSSR标记开发与应用

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老芒麦(Elymus sibiricus L.)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticea)披碱草属(Elymus)模式种植物,在青藏高原高寒牧区的人工草地建植和草原生态恢复上发挥着重要作用。目前,由于缺乏基因组信息,老芒麦分子育种方面的研究滞后不前,因此对老芒麦基因组展开测序工作,开发老芒麦基因组资源可突破瓶颈,推动老芒麦育种研究进一步发展。本研究首次以异源四倍体老芒麦“川草2号”作为材料,用高通量测序技术对其基因组进行了Survey测序。基于测序结果构建了第一个老芒麦基因组参考序列集,运用该序列集开发了单位点SSR分子标记与多位点SSR标记,并结合前人开发的另外两种SSR分子标记对54份老芒麦种质材料进行了遗传多样性和遗传结构的研究,比较评估了几种SSR分子标记的效力。主要研究结果如下:1、老芒麦基因组survey测序、组装及参数评估对老芒麦“川草2号”的基因组进行了Survey测序,测序深度58.64×,通过K-mer分析发现老芒麦的基因组是一个6.86Gb大小,重复序列比例73.23%,杂合率约0.01%,基因组GC含量约45.05%的庞大复杂类型基因组。初步组装测序结果,构建了一个含有2,506,979条基因组序列的老芒麦基因组序列集。运用同源预测和注释得到25,993个基因。2、老芒麦基因组单位点基因组SSR标记开发与评估315,446个SSR位点在老芒麦基因组序列集中被鉴定出来,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的SSR类型共占83.40%。共鉴定出483种重复基元,A/T、AG/CT、CTC/GAG、AAAAT/TTTTA和CTTTTT/GAAAAA分别为各重复类型中最丰富的重复基元。通过鉴定出的22611条单位点SSR序列开发出67,833对引物,在随机选择400对用于筛选验证后得到10对单位点SSR分子标记“ESGA-SL”和20对多位点SSR分子标记“ESGA”并在54份老芒麦种质材料上验证了标记的有效性。同时,结合其他研究者开发的15对基于FIASCO磁珠富集法开发的基因组SSR分子标记“ESGS”与15对基于转录组测序开发的EST-SSR分子标记“ES”,评估了不同类型SSR标记标记效力上的差异。结果表明,单位点标记“ESGA-SL”一共扩增出个36个等位基因,平均扩增出个3.6个等位基因,多态性信息含量(PIC)变化范围为0.400~0.700,平均值为0.505;观察杂合度(HO)变化范围为0.093~0.981,平均值为0.566。基于Mann-Whitney检验,单位点SSR分子标记在多态信息含量上显著高于其他多位点类型SSR标记,而在多位点类型SSR标记中,“ESGA”、“ESGA”和“ES”标记分别扩增出115、118和91条多态性条带,平均多态性条带百分比分别为82.62%、81.17%和76.04%。“ESGA”与“ESGS”等基因组SSR标记在多态性信息含量(PIC)、标记指数(MI)与分辨力(Rp)上显著优于基于转录组开发的EST-SSR标记“ES”。3、参试老芒麦种质遗传多样性与群体结构分析将参试的60对SSR标记引物分为两组:单位点类型SSR标记与多位点SSR标记,然后基于遗传距离矩阵的UPGMA法和主坐标分析(PCo A),使用参试的两种类型SSR标记扩增结果分别将54份参试老芒麦构建成了四个遗传类群,所构建的遗传类群与参试种质的地理分布具有高度一致性,两种分子标记基于贝叶斯算法的结构分析得到了和聚类相似的结果。遗传多样性分析和AMOVA分析显示,单位点类型分子标记在各亚群中显示的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)香农信息指数(I),期望杂合度(He),多态信息位点比例(PP)均大于多位点类型标记。在各地理亚群中,单位点标记显示的实际杂合度(Ho)变化范围为0.54~060,平均值为0.56。两种标记都显示“西伯利亚”地理亚群具有最高的遗传多样性。从遗传变异与分化上看,两种标记都显示参试老芒麦遗传变异更集中于亚群内部并且群体高度分化(单位点标记Fst=0.193,多位点标记Fst=0.265),但群体内部的各亚群两两间的遗传分化程度并不均匀。将各地理亚群进行两两比较,发现“青藏高原”地理亚群与其他地理亚群间存在高度遗传分化,而“新疆+中亚”地理亚群和“西伯利亚”地理亚群之间分化程度最低。“青藏高原”地理亚群与“新疆+中亚”、“西伯利亚”和“蒙古”地理亚群间的基因流指数Nm分别为0.755,1.173和0.701,“新疆+中亚”地理亚群和西伯利亚地理亚群间的基因流为3.92。
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