研究背景:骨肉瘤(ostesarcoma,OS)是儿童和青少年中最常见的原发性实体骨恶性肿瘤。由于缺乏有效的诊断方法,首次确诊时多数已达中晚期,肺转移率高达约20%。在过去的25年中,得益于手术和化疗的联合治疗,骨肉瘤患者的5年无瘤生存率提高到了 60-75%。然而,肿瘤转移和局部复发的患者临床预后仍较差。这迫切需求我们找出更效的骨肉瘤早期诊断、治疗和预后策略。高通量测序分析结果表明,98%的人类基因组可以转录成非编码RNA,其中长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)不能被翻译成蛋白质,但这并不意味着IncRNA是无用的,更多的证据支持lncRNA在转录和转录后水平上调控基因表达,参与胚胎发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生等活动。特别是IncRNA通过表观遗传沉默、mRNA剪接、IncRNA-miRNA相互作用、IncRNA-蛋白相互作用等方式发挥癌基因或肿瘤抑制因子的作用。在本研究中,我们通过qRT-PCR检测9对骨肉瘤及其匹配的癌旁组织,结果显示:DNAJC3-AS1在骨肉瘤组织中异常高表达,我们通过扩大样本量加以验证,并通过增高或降低DNAJC3-AS1的表达对其功能进行检测,以揭示DNAJC3-AS1在骨肉瘤发生及进展过程中所起的作用,为骨肉瘤的早期诊断和治疗策略提供更有效、更科学的依据。目的:分析长链非编码RNADNAJC3-AS1在骨肉瘤发生发展中的表达及功能。方法:1、通过qRT-PCR检测30例骨肉瘤标本及其匹配的癌旁组织中DNAJC3-ASJ的相对表达量,并且分析DNAJC3-AS沿表达水平与骨肉瘤病例相关的临床特征的关系。2、通过慢病毒转染构建稳定过表达及低表达DNAJC3-AS1的骨肉瘤细胞系HOS、SAOS-2;利用CCK-8实验、平板克隆形成实验以及软琼脂克隆形成实验测定DNAJC3-AS1对骨肉瘤细胞增殖能力的影响;通过划痕实验、细胞迁移实验分析DNAJC3CAS1对骨肉瘤细胞迁移能力的影响;通过细胞侵袭实验分析DNAJC3AS1对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响;利用细胞流式分析技术分析DNAJ1C3-AS1对骨肉瘤细胞生长周期及凋亡的影响,并进一步分析DNAJC3-AS1对骨肉瘤细胞化疗药物敏感性的影响;最后通过裸鼠动物实验分析DNAJC3-AS1对骨肉瘤细胞体内增殖、凋亡及远处转移能力的影响。3、进一步检测DNAJC3-AS1与其预测的靶基因DNAJC3之间的关系,首先在收集的30对标本中分析DNAJC3表达量并与DNAJC3-AS1表达量进行相关性分析;其次利用WB实验在蛋白质水平上验证;最后运用瞬时转染技术构建DNA1C3-AS1及IDNAJC3共转染细胞系,通过CCK-8实验、划痕实验检测其对骨肉瘤细胞增殖、迁移能力的影响,再次验证DNAJC3-AS1与DNAJC3的关系,并进一步通过WB分析及蛋白磷酸化检测DNAJC3-AS1影响骨肉瘤进展的机制。结论:1、DNAJC3-AS1在骨肉瘤组织中高表达并与骨肉瘤的分化程度、临床进展密切相关。2、DNAJC3-AS1能提高骨肉瘤细胞体内外增殖、迁移和侵袭能力,并降低骨肉瘤细胞对顺铂的药物敏感性。3、DNAJC3在骨肉瘤组织中高表达,与DNAJC3-AS1的表达成正相关关系,能够促进骨肉瘤细胞增殖迁移能力;4、DNAJC3-AS1通过DNAJC3改变eIF2α的磷酸化水平调节细胞凋亡可能是导致骨肉瘤恶性进展的机制之一。研究总结:DiVAJC3-AS1在骨肉瘤组织中高表达,并介导靶基因DNAJC3高表达,通过改变eIF2α的磷酸化水平调节细胞凋亡,促进骨肉瘤的恶性进展。揭示了DNAJC3-AS1存在作为评价骨肉瘤进展和预后的生物标记物的潜能,可作为骨肉瘤治疗的研究靶点。