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研究背景和目的肝细胞肝癌(Hepatocellμlar carcinorma, HCC)是常见的恶性肿瘤,恶性度高、进展迅速,无法早期诊断,治疗困难、死亡率高[¨。其发病机制至今尚未完全明确,并且缺乏准确的早期诊断方法和有效的针对性治疗措施。明确肝癌尤其是HBV相关肝癌的发病机制,一直是肝癌防治研究中的关键问题之一。而准确的早期诊断方法和有效的靶向治疗肝癌的药物仍是多年来国内外研究探求的目标。纳米材料是指晶粒尺寸为纳米级(10-9米)的超细材料。具有独特的结构,其外表面除了可以非共价力吸附各种分子,还可以结合多种化学分子基团,其内部空间则可以包埋离子以及一些小分子,并且能够穿越细胞质膜,在生物医学,包括药物传递、基因治疗等方面具有较好的应用前景。本实验通过在培养液中添加不同浓度二氧化钛纳米粒子(Titanium dioxide nanoparticles, TiO2-NPs),探讨不同浓度的TiO2-NPs对肝癌细胞生物学功能的影响。Sandra Vranic等的研究结果表明,细胞能够通过胞饮这种依赖能量的内化途径摄取NPs,同时部分NP也可以通过被动扩散进入细胞内。为进一步探讨TiO2-NPs进入细胞的跨膜机制,通过在培养液中添加不同浓度的钾离子,通过研究细胞膜通透性的改变对TiO2-NPs的影响,探讨钾离子对TiO2-NPs的协同作用。1.探讨TiO2-NPs对人正常肝细胞系L02和人肝肿瘤细胞系HepG2细胞生物学功能的影响及其调控机制；2.探讨钾离子对L02和HepG2细胞生物学功能的影响及其调控机制；3.探讨钾离子协同TiO2-NPs对L02和HepG2细胞生物学功能影响及其调控机制。方法1.采用扫描电镜检测TiO2-NPs的直径及能谱元素分析；2.采用细胞计数、CCK-8检测法、流式细胞术等方法,检测TiO2-NPs对L02和HepG2细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响；3.应用蛋白免疫印迹法(Western Blot)、caspase3/7检测试剂盒检测TiO2-NPs对L02和HepG2细胞凋亡相关蛋白caspase-3、膜通道蛋白aENaC的表达水平以及caspase-3/7活性的影响；4.应用Western Blot、 JC-10线粒体膜电位检测试剂盒、ATP/ADP试剂盒等方法检测TiO2-NPs对线粒体相关蛋白SIRT3、VDAC1、ACSS1表达水平以及对线粒体膜电位、ADP/ATP水平的影响；5.采用细胞计数、CCK-8检测法、流式细胞术等方法,检测钾离子对L02和HepG2细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响;6.应用Western Blot、caspase3/7检测试剂盒检测钾离子对L02和HepG2细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3,通道蛋白HERG的表达水平以及caspase-3/7活性的影响；7.应用Western Blot、JC-10线粒体膜电位检测试剂盒等方法,检测钾离子对线粒体相关蛋白VDAC1、ACSS1的表达水平以及对线粒体膜电位的影响。结果1.TiO2-NPs的粒子直径15nnm左右,纯度约95%。TiO2-NPs能够抑制]HepG2细胞生长及增殖,使其S期受抑制,诱导HepG2发生凋亡,随着浓度的增高,对增殖的抑制及细胞周期的影响更为明显,使凋亡率明显增加,呈现明显的浓度依赖性。对L02细胞的生长、增殖、周期及凋亡的影响无明显差异；2. Western Blot结果显示,在HepG2细胞中,TiO2-NPs使凋亡相关蛋白caspase-3、膜通道蛋白αENaC的表达明显上调,且呈一定的浓度依赖性。在L02细胞中,caspase-3、αENaC的表达水平无明显变化；3. TiO2-NPs能够使HepG2细胞的线粒体膜电位呈去极化,并且能够使HepG2细胞的呼吸链关键蛋白ACSS1表达水平下调,线粒体相关蛋白SIRT3、VDAC1的表达水平上调。在L02细胞中,SIRT3、VDAC1、ACSS1的表达均无明显变化;4.钾离子能够抑制L02和HepG2细胞的生长及增殖,使其S期受抑制,诱导其凋亡,随着浓度的增高,对增殖、周期的抑制更明显,凋亡率明显增加,呈现明显的浓度依赖性。对HepG2细胞生物学功能的影响更加显著；5. Western Blot结果显示,钾离子能够使L02和HepG2细胞凋亡相关蛋白Bax、 caspase-3表达明显上调,Bcl-2明显下调,且呈一定的浓度依赖性,在HepG2细胞中更加明显;6.钾离子能够使HepG2和L02细胞的线粒体膜电位呈去极化,线粒体表面孔蛋白VDAC1、离子通道蛋白HERG的表达水平上调,在HepG2细胞中更显著。并且能够使HepG2细胞的呼吸链关键蛋白ACSS1表达水平下调。结论TiO2-NPs对HepG2细胞有显著的促进凋亡、抑制其生长和增殖的作用,使其细胞周期出现S期阻滞,对L02细胞的生物学功能无明显影响。TiO2-NPs诱导HepG2细胞凋亡是通过调节细胞内渗透压,上调通道蛋白aENaC,使HepG2细胞线粒体膜电位发生去极化,诱导孔蛋白VDAC1表达上调,造成Cyt-c和ATP的流失,进一步激活caspase-3实现的；钾离子能够抑制L02和HepG2细胞的生长和增殖,诱导细胞发生凋亡。钾离子诱导的细胞凋亡是通过调节Bcl-2家族成员和caspase-3表达,使L02和HepG2细胞线粒体膜电位发生去极化,尤其是在HepG2细胞中影响更为明显。钾离子对细胞的这些生物功能的影响与离子通道蛋白HERG相关。