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目的:观察17β-雌二醇(17β-estradiol, 17β-E2,以下简称E2)对由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)凋亡的影响及其影响机制,旨在探讨雌激素抑制动脉粥样硬化和减少女性冠心病的可能机制。过去有关雌激素对EPCs影响的研究多着重于促进EPCs增殖迁移和血管生成方面,而对EPCs凋亡方面则重视不够。本实验使用ox-LDL作为诱导剂来观察E2对内皮细胞的前体EPCs凋亡的影响。由于ox-LDL在动脉粥样硬化(AS)中的重要地位,因此雌激素抑制由ox-LDL诱导的凋亡更能说明其抗AS作用。本研究还就E2对抑制凋亡的机制和途径进行观察,即观察E2是否通过其受体起作用,是否与PI3K/Akt途径有关。方法:(1)外周单个核细胞的分离:肝素抗凝抽取人外周血50ml(肝素1000U)。PBS对倍稀释,按1:1加在人淋巴细胞分离液上,2000R/min离心,吸取中间白膜层单个核细胞,1500R/M离心洗涤三次,取细胞悬液与等体积2g/L台盼蓝混合,进行细胞活力计算(死细胞-蓝色、活细胞不着色),活细胞数占98%以上可进行接种。以上在抽取血样后四小时内完成。(2)诱导分化:纤连蛋白用PBS溶解稀释为1 ng/ml后包被24孔板,每孔中加入100ul ,置于37℃温箱中孵育2h ,临用前吸出多余的液体,用PBS洗涤两次。分用M199培养液调整细胞密度,接种于培养瓶中,成纤维细胞多于24小时内贴壁,因此培养24小时后取未贴壁细胞以4×106/cm2密度接种于包被有纤维连接蛋白(FN)的24孔培养板(每孔M199培养液1 ml),添加10 %胎牛血清、1 %青链霉素(1万单位/ml)、VEGF 50 ng/ml、b-FGF 1 ng/ml,置于5%CO2、饱和湿度、37oC孵育箱中培养四天,用磷酸盐缓冲液洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7d ,进一步用PBS洗掉非贴壁细胞,贴壁细胞供实验用。(3)EPCs鉴定:利用免疫组化法检测细胞表抗CD34及VEGFR-2 ;利用免疫荧光法检测细胞表抗CD 133;用EPCs特异性抗体DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1对贴壁细胞进行免疫荧光染色。(4)EPCs调亡的观察:采用异硫氰酸荧光素标记的Annexin-v、碘化丙锭(PI)双染色免疫荧光法检测EPCS的凋亡。贴壁细胞直接用盖玻片来培养7d后,用PBS洗涤两次,在500ul的Binding Buffer中加入2ul异硫氰酸荧光素标记的Annexin-v、5ul PI混匀。将上述溶液加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖,避光,室温反应10分钟。将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下双色滤光片观察。(5)E2对EPCs凋亡的观察:用不同浓度E2干预经ox-LDL诱导凋亡的EPCs,观察其剂量依赖性及时间依赖性。(6)机制研究加入雌激素受体阻断剂ICI182,780及PI3K抑制剂LY294002后观察凋亡的影响。结果:1. E2对EPCs的自然凋亡有抑制作用,100 nmol/L浓度E2作用下的凋亡率为(8.23±0.6)%,与空白对照组(12.31±0.34)%的凋亡率相比有明显的统计学意义(P<0.01)。2. E2抑制ox-LDL诱导的EPCs凋亡具有剂量依赖性。在E2浓度10nmol/L-100 nmol/L范围内随着其浓度的增加,在干预24h后检测,其抗凋亡的作用逐渐增强。在10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L浓度E2下凋亡率依次为(22.39±0.68)%、(20.42±2.56)%、(13.93±0.3)%,与ox-LDL诱导组(31.43±1.05)%的凋亡率比较,有显著的统计学意义(P<0.01)。在干预48h后检测凋亡率依次为(23.28±0.64)%、(19.25±1.16)%、(14.57±0.45)% ,与24h结果的比较无明显统计学意义(P>0.05)。3.雌激素受体阻断剂ICI182,780与PI3K抑制剂LY294002能够明显抑制E2的抗凋亡作用,加入雌激素受体阻断剂ICI182,780组的凋亡率上升至(28.6±1)%,加入PI3K抑制剂LY294002组的凋亡率上升至(25.2±1)%,与E2组(13.9±0.3)%的凋亡率相比有明显统计学意义(P<0.01)。结论:1.17β-雌二醇具有抑制人外周血内皮祖细胞凋亡的作用。2.ox-LDL具有诱导人外周血内皮祖细胞凋亡的作用,而17β-雌二醇可以呈浓度依赖性的对抗ox-LDL诱导内皮祖细胞凋亡的作用。3.17β-雌二醇抑制ox-LDL诱导人外周血内皮祖细胞凋亡作用的机制与雌激素受体及PI3K通路有关。