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肝细胞癌是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤,其致死率在世界范围内已跃居癌症的第二位。早期肝癌患者可通过部分肝切除术或肝移植治疗取得较好的效果,但大多数患者确诊时已是中晚期,只能通过肝动脉化疗栓塞术或化疗等手段进行姑息治疗,效果并不理想。近年来,肝癌免疫疗法成为了肝癌治疗研究的热点,肝癌的免疫疗法包括细胞因子疗法、免疫检查点抑制剂疗法、肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAAs)靶向疗法等。树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗是其中的一种,它是经肿瘤抗原或肿瘤细胞裂解物(tumor cell lysate,TCL)致敏后作为疫苗使用的DCs,该疫苗是通过诱导机体产生抗原特异性免疫应答而发挥抗肿瘤效果的。目前已经有大量关于DC疫苗成功应用于癌症治疗的研究被报道,初步证明了DC疫苗对于肝癌患者是一种安全有效的治疗方式。但现存的一个问题是多数肿瘤相关抗原是机体自身蛋白质成分,单纯的TAAs产生的免疫刺激信号难以激发机体先天性免疫反应。因而,加入适当的佐剂帮助TAAs刺激活化DC疫苗或许能取得更好的疗效。在前期研究中,我们发现硫酸化可德兰多糖(curdlan sulfate,CS)是一种具有免疫调节活性的多糖衍生物,将其用作乙肝疫苗佐剂免疫小鼠时,发现CS能显著增强HBsAg的免疫原性,促进抗原递呈细胞及T细胞活化,提高乙肝抗原特异性抗体水平,具有潜在的佐剂开发价值。因此在本课题中,我们制备了不同硫酸化程度和分子量的CS,研究了其体外免疫调节活性并筛选活性最好的CS用作DC疫苗佐剂来治疗肝癌小鼠,以期能发挥佐剂效果增强DC疫苗治疗效果。本课题研究内容主要包括:(1)采用SO3-吡啶反应体系,通过控制投料比和反应温度制备不同硫酸化程度和分子量的CS;采用红外光谱分析仪、元素分析仪及多角度激光散射仪对所制备样品进行结构表征。(2)采用小鼠脾淋巴细胞体外增殖以及小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)体外活化实验对所制备的样品的进行活性测定,筛选出相对活性最高的CS样品及浓度进行下游DC疫苗佐剂体内活性研究。(3)采用将H22细胞直接接种BALB/c小鼠的方法建立肝癌模型;分别将PBS、未致敏DC、TCL致敏DC、CS活化DC、CS+TCL致敏DC以及TCL+LPS致敏DC疫苗皮下注射模型小鼠,分4周期给药,通过比较瘤体积及监测生存期进行药效学评价。(4)采用免疫组化方法测定小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润及MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CD86表达水平差异和荧光定量PCR的方法,测定小鼠肿瘤组织中TNF-α、IFN-γ和TGF-β的mRNA表达差异进行免疫治疗药效学研究。(5)采用dectin-1、TLR2和TLR4受体抑制的方法,测定受体抑制后CS对DCs的活化效果,进行CS用作DC疫苗佐剂的分子机制研究。研究结果与结论:(1)通过控制S03-吡啶投料比例及反应温度成功制备了 4种不同硫酸化程度及分子量的CSs。通过红外光谱、多角度激光散射和元素分析检测,发现通过控制投料比例可以控制硫酸化修饰程度,控制反应温度可以控制可德兰多糖断裂程度,从而控制产物的硫酸化修饰度及分子量。(2)对制备的CSs进行免疫活性研究,发现CSs均具有明显的促小鼠脾淋巴细胞增殖活性和诱导树突状细胞成熟标志分子和共刺激分子表达活性,刺激细胞成熟。(3)对CSs构效关系研究发现,分子量对CS活性影响较弱,而硫酸化程度对CS免疫调节活性影响明显,且硫酸化程度与CS的免疫活性呈正相关。(4)将CS用作树突状细胞疫苗佐剂治疗肝癌小鼠,可显著提高树突状细胞疫苗对肝癌小鼠的治疗作用,降低瘤体积、减小肿瘤重量并延长小鼠生存期。(5)CS佐剂作用后的树突状细胞疫苗,能明显增加肿瘤组织内MHC Ⅰ、MHC Ⅱ和CD86的表达,促进CD8+T细胞浸润。同时明显上调肿瘤组织内免疫增强信号分子TNF-α和IFN-γ的表达,下调免疫抑制信号分子TGF-β的表达。(6)CS用作DC疫苗佐剂的分子机制研究发现,dectin-1不参与CS对DCs的活化,TLR4和TLR2为CS作用受体,其中TLR4为主要作用受体。本课题研究让我们对CS的免疫调节活性有了更深的认识,对硫酸化修饰改性相关研究有重要参考意义,而且相关成果为CS用作免疫佐剂的应用开发提供了实验依据。本研究期望为肝癌的治疗提供新的思路及策略。