背景创伤性脊髓损伤可以导致不同程度的感觉和运动功能障碍,严重者可导致瘫痪,为家庭及社会带来巨大负担。严重的创伤性脊髓损伤目前并无高效的治疗方法。根据致伤因素不同和时间发生顺序的先后,创伤性脊髓损伤可分为两个时相,即原发性损伤期和继发性损伤期,在这两个时期造成的脊髓损伤分别称为脊髓原发性损伤(主要包括挤压伤、创伤、横断伤等机械性损伤)和脊髓继发性损伤。在创伤性脊髓损伤的继发性损伤期,多种生物活性物质释放,如活性氧簇物质(ROS)的释放,羟基、氧自由基、超氧化合物、脂质过氧化物、氮氧化合物可以产生氧化应激作用,干扰细胞正常代谢,增强炎症细胞的浸润,引起炎症反应的加重,甚至最终导致神经元细胞以及神经胶质细胞坏死和凋亡,造成不可逆的中枢神经组织损伤。此外,在创伤性脊髓损伤的继发性损伤时期,炎症反应对于脊髓继发性损伤起到了至关重要的作用。在这一时期,脊髓组织内的巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞被活化,释放大量炎症因子和趋化因子,诸如IL-1β、TNF-α、IL-6等,可引起一系列复杂的炎症级联反应,最终导致脊髓出现脱髓鞘、灰质溶解、结缔组织沉积以及反应性胶质化形成胶质瘢痕等,造成神经功能严重损伤并阻碍神经细胞再生修复。氢气作为治疗性医用气体最早见于Dole在1975年的报道,证实其可有效抑制白化裸鼠鳞状上皮细胞癌的发展。之后,对氢气在生物医学领域的研究逐渐深入,并发现分子氢对心脏、肝脏、肾、肺、脑、胰腺、小肠、结肠、脊髓、视网膜、听毛细胞等多种器官及组织具有损伤保护作用,并对2型糖尿病等代谢性疾病有缓解治疗作用,此外,对于速发型超敏反应也有一定的抑制作用。多项研究已经证明,分子氢安全无生物毒副作用,制备简便,可通过多种途径给药,有学者研究发现,分子氢通过直接吸入、氢饱和生理盐水静脉注射、氢饱和生理盐水腹腔注射、氢饱和纯净水饮用、氢饱和生理盐水滴眼,都可达到较好效果的抗损伤治疗效果。氢分子进入体内后可通过弥散作用自由透过细胞膜和细胞器膜,发挥抗氧化、抗凋亡、抗炎症反应以及抗超敏反应的作用,最终形成达到保护组织器官损伤的治疗效果。Ohsawa等研究者于2007年首次将氢气应用于改善神经系统损伤,证实了氢分子对脑部缺血-再灌注损伤具有良好的抗氧化保护作用,从而开启了氢在神经系统疾病领域的研究。氢在脊髓损伤中的研究目前多集中于脊髓缺血再灌注损伤,对于在急性创伤性脊髓损伤中氢分子的抗炎症反应作用研究甚少。目的本实验将氢饱和生理盐水通过腹腔注射作用于创伤性脊髓损伤SD大鼠模型,目的在于研究氢饱和生理盐水在创伤性脊髓损伤中对脊髓损伤区域小胶质细胞和星形胶质细胞激活、趋化聚集的影响,以及对炎症因子IL-1β、TNF-α释放的抑制作用,并进一步研究氢饱和生理盐水对创伤性脊髓损伤继发损伤期损伤区域嘌呤能受体P2X7R在小胶质细胞中活化表达的影响以及P2Y2R在星形胶质细胞中活化表达的影响,探讨P2X7R与P2Y2R的特异性配体三磷酸腺苷(ATP)在炎症反应中的重要作用,考察分子氢在脊髓损伤后的抗炎症反应效应,以期为临床脊髓损伤提供一种新的抗炎症反应治疗方法。方法1.SD大鼠创伤性脊髓损伤模型的建立:取雄性Sprague-Daley大鼠72只,体重250-300g,随机等分三组:假手术+生理盐水注射组(Sham),手术+生理盐水注射组(Control),手术+氢饱和生理盐水注射组(HS)。三组大鼠均行胸椎(T7-T8)椎板切除术,手术组根据Gruner介绍的自由落体脊髓打击方法建立大鼠脊髓急性创伤模型,假手术组只进行椎板切开,不进行脊髓打击处理。24只大鼠于脊髓损伤后4小时处死,其余所有大鼠均于脊髓损伤后96小时处死。2.氢饱和生理盐水的制备:根据Ohsawa介绍的方法,将氢气在0.4MPa的条件下溶解于生理盐水6小时,即可成功制备氢饱和生理盐水,保持氢在生理盐水中的浓度不低于0.6nmol/L,并保存于加压密封铝包中备用。3.氢饱和生理盐水干预:在SD大鼠脊髓损伤后0小时、24小时、48小时、72小时分别进行普通生理盐水和氢饱和生理盐水腹腔注射,注射计量为10 ml/kg体重。假手术+生理盐水注射组(Sham)注射普通生理盐水;手术+生理盐水注射组(Control)注射普通生理盐水;手术+氢饱和生理盐水注射组(HS)注射氢饱和生理盐水。4.SD大鼠脊髓损伤96小时后,采集大鼠血清及脑脊液样本,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定其外周血和脑脊液中炎症因子TNF-α和IL-1β的含量水平。5.SD大鼠脊髓损伤96小时后,以打击点为中心采集脊髓组织样本,PFA固定后冰冻切片,通过免疫荧光技术测定受损区域小胶质细胞、星形胶质细胞活化和趋化聚集水平,同时进行嘌呤能受体P2X7R与小胶质细胞共标免疫荧光染色,评估P2X7R在小胶质细胞上的表达变化以及嘌呤能受体P2Y2R与星形胶质细胞共标免疫荧光染色,评估P2Y2R在星形胶质细胞上的表达变化。6.SD大鼠脊髓损伤96小时后,以打击点为中心采集脊髓组织样本,通过WesternBlotting技术测定损伤区域嘌呤能受体P2X7R与P2Y2R的蛋白表达水平。7.分别在SD大鼠脊髓损伤4小时和96小时后,采集脑脊液,用细胞外ATP浓度检测试剂盒进行脑脊液ATP含量测定。8.SD大鼠脊髓损伤96小时后,以打击点为中心采集脊髓组织样本,PFA固定后石蜡包埋切片,分别进行HE染色以及TUNEL、caspase-3免疫组织化学染色,从组织形态学评估脊髓损伤程度、炎症细胞浸润程度以及脊髓细胞凋亡程度。9.BBB运动功能评分:在SD大鼠脊髓损伤模型建立前以及建立之后24小时、48小时、72小时、96小时分别进行BBB运动功能评分(Basso Beattie Bresnahan scale),并由不同观察者独立记录大鼠后肢运动功能变化情况。10.统计学处理方法:用SPSS软件进行统计分析。记录数据表示为平均值±标准差((?)±S)。组间两两比较使用SNK-q检验。P<0.05被认为具有统计学差异。结果1.成功建立SD大鼠创伤性脊髓损伤模型。成功制备氢饱和生理盐水。2.SD大鼠脊髓损伤96小时后,手术+氢饱和生理盐水腹腔注射组(HS)的外周血和脑脊液中TNF-α和IL-1β水平较手术+生理盐水注射对照组(Control)均出现明显下降。其中,外周血TNF-α水平从653.58±50.27pg/ml降至401.91±23.84pg/ml;脑脊液TNF-α水平从203.53±58.85pg/ml降至84.87±19.20pg/ml。外周血IL-1β水平从476.88±37.80pg/ml降至277.19±33.73pg/ml;脑脊液IL-1β水平从83.05±6.53pg/ml降至46.68±5.14pg/ml。3.免疫荧光染色显示,大鼠脊髓损伤96小时后,手术+生理盐水注射对照组(Control)脊髓损伤区域的小胶质细胞和星形胶质细胞被激活,发生趋化聚集。手术+氢饱和生理盐水腹腔注射(HS)干预可明显减轻脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的活化和集聚。嘌呤能受体P2X7R在小胶质细胞的表达与小胶质细胞活化程度表现一致,P2Y2R在星形胶质细胞的表达与星形胶质细胞活化程度表现一致,氢饱和生理盐水干预同样可以抑制P2X7R和P2Y2R的表达。4.SD大鼠脊髓损伤96小时后,对损伤脊髓打击区域组织进行Western Blotting检测显示,手术+生理盐水注射对照组(Control)大鼠脊髓损伤区域嘌呤能受体P2X7R和P2Y2R蛋白表达水平升高,手术+氢饱和生理盐水腹腔注射(HS)干预可显著降低P2X7R以及P2Y2R蛋白含量水平。5.SD大鼠脊髓损伤4小时后,进行脑脊液ATP含量测定,手术+生理盐水注射对照组(Control)大鼠脑脊液中ATP含量迅速上升至600.40±149.90nmol/L,手术+氢饱和生理盐水腹腔注射(HS)干预可使ATP含量下降至144.51±25.13nmol/L。髓损损伤96小时后,相对于手术+生理盐水注射对照组(Control),手术+氢饱和生理盐水腹腔注射(HS)干预可使脑脊液中ATP含量从220.70±35.49 nmol/L降至118.21±16.29 nmol/L。6.HE染色显示,大鼠脊髓损伤96小时后,手术+生理盐水注射对照组(Control)大鼠损伤区域脊髓组织出现大量炎症细胞浸润和组织液化,手术+氢饱和生理盐水腹腔注射(HS)干预可减轻炎症细胞浸润和脊髓组织液化程度。细胞凋亡相关TUNEL、caspase-3免疫组织化学染色显示,大鼠脊髓损伤96小时后,手术+生理盐水注射对照组(Control)大鼠脊髓损伤区域出现大量凋亡细胞,手术+氢饱和生理盐水腹腔注射(HS)干预可明显减少凋亡细胞数量。7.大鼠脊髓损伤96小时后,手术+氢饱和生理盐水腹腔注射组(HS)大鼠的的后肢运动功能BBB评分在脊髓损伤后24小时、48小时、72小时、96小时明显高于手术+生理盐水干预对照组(Control),提示大鼠脊髓损伤后氢饱和生理盐水干预可使大鼠后肢运动功能更好恢复。结论1.创伤性脊髓损伤可导致SD大鼠运动功能减退,并在脊髓损伤局部可出现炎症细胞浸润和组织液化,小胶质细胞和星形胶质细胞激活并大量聚集,炎症因子TNF-α、IL-1β含量水平上升,说明创伤性脊髓损伤在损伤继发期出现了明确的炎症反应。2.与炎症因子IL-1β和TNF-α释放与小胶质细胞活化密切相关的重要嘌呤能受体P2X7R在小胶质细胞中的表达与小胶质细胞活化水平一致,同时与IL-1β和TNF-α含量水平变化相一致,说明P2X7R在创伤性脊髓损伤继发期炎症反应中具有重要作用。3.嘌呤能受体P2Y2R在星形胶质细胞中的表达与星形胶质细胞活化水平相一致,说明P2Y2R与脊髓星形胶质细胞活化、增生密切相关,在创伤性脊髓损伤继发期胶质瘢痕形成中具有重要作用。4.ATP作为嘌呤能受体P2X7R和P2Y2R的特异性配体,其在脑脊液中的含量水平在创伤性脊髓损伤初期(4小时)即可出现显著上升,这一现象与脊髓组织遭受机械性打击损伤造成的细胞破裂ATP释放有关。在SD大鼠脊髓损伤96小时后,脑脊液中ATP含量水平仍保持较高水平,这与ATP刺激星形胶质细胞和凋亡细胞上的另一嘌呤能受体P2Y2R使ATP不断持续释放有关。5.脑脊液中ATP含量水平变化与P2X7R表达水平变化以及小胶质细胞活化水平和IL-1β和TNF-α释放水平均呈现一致变化趋势,提示ATP引起的P2X7R活化进而介导炎症因子的释放是脊髓损伤继发期炎症反应的一个路径。另外,ATP含量水平变化与P2Y2R表达水平以及星形胶质细胞的活化增殖水平均呈现一致变化趋势,提示ATP引起的P2Y2R活化是介导星形胶质细胞在脊髓炎症反应继发期激活并形成胶质瘢痕的一个路径。6.氢饱和生理盐水干预可以明显抑制创伤性脊髓损伤后脑脊液中ATP的释放,降低嘌呤能受体P2X7R和P2Y2R的表达,并抑制脊髓损伤继发期小胶质细胞和星形胶质细胞的活化聚集,减轻细胞凋亡,有效降低炎症因子IL-1β和TNF-α水平,促进脊髓损伤后的运动功能改善。