单分子荧光共振能量转移技术被广泛应用于研究解旋酶,通过探测标记在分叉DNA两条尾链上荧光对之间距离的变化来研究解旋酶和DNA的相互作用。然而,由于尾链悬端的热涨落和随机干扰,使得荧光共振能量转移技术对于揭示解旋酶的步进机制缺乏1bp分辨精度,大多数解旋酶台阶动力学机制并不清楚。本文设计了纳米张力器技术,通过一段短的双链DNA弯曲产生力的作用来增大荧光染料对之间的距离,从而提高荧光共振能量转移技术,使之能分辨0.5bp的解旋酶步进大小。并以Pif1解旋酶为例,揭示Pif1解旋酶1bp的均一步进台阶。超高精度荧光共振能量转移技术可以被广泛应用于解旋酶和聚合酶的研究,揭示统一的、基本的分子马达机制。Pif1解旋酶是多功能解旋酶,它参与了冈崎片段成熟、DNA双链断裂诱导合成、端粒维护和线粒体稳定等生理过程。Pif1解旋酶在冈崎片段成熟和DNA双链断裂诱导合成过程中要求有强烈不同的持续解旋能力,持续解旋能力如何调控并不清楚;Pif1在细胞内浓度低,而离体实验在相对较高浓度下才能有效解旋双链DNA;在单链DNA上Pif1有长的移位能力,但现有研究表明它有低的持续解旋能力或不解旋。这些结果说明Pif1研究现状存在很多问题,最根本的内在分子机制没有解决。从而研究Pif1分子解旋机制变得十分重要。单分子荧光共振能量转移技术研究结果表明,Pif1单体可以重复地解开分叉DNA双链。它对分叉DNA结构岔口具有高亲和力,Pif1解开分叉双链DNA具有大约10bp的低持续解旋能力。同时荧光共振能量转移技术和磁镊技术研究表明,Pif1是受力调控的解旋酶,其持续解旋能力和解旋速率随着力的增加而增加,这种力的效果可能与Pif1的细胞功能相关。另外,超高分辨率荧光共振能量转移技术对Pif1步进台阶分析,得到Pif1打开碱基对和核苷酸尾链的释放独立异步解旋模型。Pif1打开多个碱基对后释放一次核苷酸尾链,平均每打开两个碱基对释放一次核苷酸尾链。Shelterin是端粒保护帽状结构的蛋白复合体,能保护端粒免于被DNA损伤修复机制蛋白识别和作用,shelterin包含POT1、TPP1、TIN2、TRF1、TRF2和RAP1六种组分。RPA是DNA损伤修复机制信号蛋白,能非特异性结合端粒单链DNA。POT1如何保护端粒单链DNA抵御相似DNA亲和力但浓度千倍的RPA是一个看似矛盾的问题。利用荧光共振能量转移技术揭示了 RPA在高浓度下与端粒DNA稳定结合,仅有POT1保护端粒DNA不能抵御RPA,但shelterin在对POT1无栓系稳定下能增强端粒DNA抵御RPA的能力,增强能力可达3-5倍。实验首次利用单分子技术研究了 shelterin和RPA在端粒DNA上的动态相互作用。