纳米材料作为21世纪经济和社会发展最重要的物质基础,已经在化工、医疗、食品和电子科技等领域造成产业化的革新,并渗透到我们生产和生活的方方面面。其中纳米二氧化硅（SiO₂-NPs）已经成为面向社会大众应用最多的纳米材料之一。但是由于SiO₂-NPs的小尺寸效应、高稳定性和高反应活性等特点使其对人类的生命健康产生了极大的威胁,近年来已经引起了各国政府和公众的密切关注。心血管疾病是21世纪致死率最高的世界性疾病,流行病学调查研究显示,细小颗粒物的暴露与心血管疾病的联系密切相关。而纳米颗粒在人群中的暴露已经越来越普遍,因此对纳米材料的心血管毒性研究和机制分析有利于我们为其毒性干预和治疗提供科学性的依据。第一部分:血管内皮细胞是形成血管内壁的主要细胞,具有维持血管稳态的重要功能,因此本章将以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为体外细胞模型来探究SiO₂-NPs诱导血管内皮毒性损伤的分子机制。我们选用三种粒径不同的SiO₂-NPs在不同的浓度下对HUVECs作用不同的时间后,用CCK-8检测了其对细胞的增殖毒性影响。结果发现粒径越小的SiO₂-NPs对HUVECs的毒性作用越强,并且这种毒性效应具有时间和剂量上的依赖性。与对照组相比,暴露SiO₂-NPs后,HUVECs细胞释放的LDH明显增加,伴随着胞内ROS水平上调,细胞内的GPx酶活性降低,并且细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达显著增加,这些结果表明SiO₂-NPs造成了HUVECs的氧化应激和炎性损伤。通过免疫荧光和免疫共沉淀实验,暴露SiO₂-NPs后,与对照组相比,结果发现HUVECs细胞内HMGB1的核质转移及释放量显著增多且HMGB1的赖氨酸乙酰化水平也明显上调。接下来,我们采用瞬时转染Sirt1-siRNA方法和加入Sirt1的抑制剂Ex527对HMGB1的去乙酰化酶Sirt1进行干扰或者抑制表达后,再暴露SiO₂-NPs,结果显示HMGB1的核质转移量明显增多,同时伴随着细胞炎性因子和黏附分子的表达上调;而用瞬时转染PCAF-siRNA方法对HMGB1乙酰化酶PCAF进行干扰后,则表现出与干扰Sirt1相反的趋势。这些结果表明SiO₂-NPs诱导的HMGB1的核质转移和释放需要经过相关激酶的乙酰化修饰。为了进一步验证HMGB1在HUVECs细胞炎症反应中的作用,我们采用瞬时转染HMGB1-siRNA干扰HMGB1的表达,在mRNA和蛋白水平均发现SiO₂-NPs诱导的细胞炎性因子和黏附分子都明显下调。接下来用Z-VAD-FMK（caspase家族抑制剂）或Ac-YYAD-CHO（caspase1抑制剂）抑制caspase1的表达后,均发现HMGB1的表达减少且伴随着细胞炎性因子和黏附分子的表达降低。同样的,采用瞬时转染NLRP3-siRNA干扰NLRP3的表达后,也发现类似的效果。这些结果证明NLRP3炎性小体参与调控HMGB1的核质转移和释放。另外在给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或夹竹桃麻素（APO,NADPH氧化酶抑制剂）处理后,均发现NLRP3炎症小体相关蛋白的表达降低且同时伴随着HMGB1的表达及释放减少。这些实验结果表明ROS在NLRP3炎症小体调控HMGB1核质转移和释放中扮演着重要角色。进一步探究HMGB1的信号通路机制时,我们发现SiO₂-NPs同时诱导了Toll样受体和RAGE受体的高表达,并促进了这些受体与HMGB1的结合,其中对TLR4的作用最明显。接下来,分别瞬时转染TLR4-siRNA和MyD88-siRNA抑制TLR4和MyD88的表达后,在mRNA和蛋白水平均发现细胞炎性因子和黏附分子的表达降低。同时,暴露SiO₂-NPs后,我们还发现NF-κB通路的激活。以上的实验结果表明,HUVECs暴露SiO₂-NPs后,会产生大量活性氧,造成细胞内的氧化应激,激活NLRP3炎症小体,促使HMGB1发生赖氨酸乙酰化修饰并从细胞核转移到细胞质进而释放到细胞外,激活靶细胞TLR4/MyD88和NF-κB信号通路从而对细胞造成炎性损伤。第二部分:该部分旨在研究SiO₂-NPs通过呼吸方式暴露后对小鼠血管内皮的毒性效应。我们首先用荧光纳米二氧化硅（F-SiNPs）观察了纳米二氧化硅在小鼠体内的分布及代谢情况。气管滴注F-SiNPs,24 h后,取小鼠离体的心肝脾肺肾,通过荧光成像实验,结果显示F-SiNPs可以由肺部进入血液循环系统,随后被肝脏富集,再经过肾脏排出体外。接下来,小鼠气管滴注SiO₂-NPs 24h后,取小鼠的肺脏进行透射电镜分析,结果显示SiO₂-NPs的暴露会对小鼠气血屏障的结构造成损伤,使得纳米颗粒可以轻易的穿过气血屏障进入血液循环系统。为了考察SiO₂-NPs对小鼠血管内皮的毒性损伤效应,我们将雄性昆明小鼠随机分为四组,然后通过鼻腔滴注模拟呼吸方式暴露,给予实验组小鼠不同剂量的SiO₂-NPs生理盐水悬液,对照组小鼠给予等量的生理盐水。连续给药15天后,取小鼠的血液,肺脏和主动脉瓣。通过ICP-OES对血液中的硅元素进行定量分析,结果发现鼻腔滴注SiO₂-NPs会导致小鼠血液中的硅元素含量升高,并且随着SiO₂-NPs的剂量增大,血液中的硅元素呈依赖性的上调。随后对血清蛋白进行Westernblot分析,结果显示SiO₂-NPs的暴露会导致小鼠血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β和黏附分子sICAM-1、sVCAM-1的表达升高,并且随着暴露SiO₂-NPs浓度的增加,蛋白表达量呈依赖性上调。这些炎症因子和黏附因子都是血管内皮细胞受到损伤时释放的标志性蛋白,证明SiO₂-NPs的暴露会造成小鼠血管内皮功能障碍。进一步分析,结果发现SiO₂-NPs的暴露会诱导血清中乳酸脱氢酶的释放增多,并且破坏机体氧化还原的平衡,导致血清中谷胱甘肽含量降低和谷胱甘肽过氧化物酶的活性减弱。小鼠肺部HE染色和SR（天狼猩红-苦味酸）染色结果表明SiO₂-NPs的暴露导致了肺部明显的炎症损伤和纤维化的病变;但是血管的HE染色和油红O染色并未显示小鼠血管明显的病理组织损伤。大量研究表明血管损伤需要一个长期的过程,这说明短期急性暴露SiO₂-NPs后,轻微的氧化应激损伤和炎性因子的上调,并不会破坏血管细胞的完整性进而引发严重的血管内皮组织病理性损伤。为了探究SiO₂-NPs诱导的血管损伤是纳米二氧化硅颗粒引起的还是硅元素引起的,我们把HUVECs暴露在硅元素含量相同的SiO₂-NPs和硅酸盐中,通过CCK-8和LDH实验,结果发现SiO₂-NPs诱导HUVECs释放大量的LDH且抑制了细胞增殖,并随着SiO₂-NPs暴露浓度的增加,细胞毒性损伤变得更明显;而无论是高剂量还是低剂量的硅酸盐暴露,均不引起HUVECs细胞的毒性损伤。本章实验证明,通过鼻腔滴注模拟呼吸方式暴露的SiO₂-NPs,可以穿过气血屏障进入血液循环系统,并在肝脏和肾脏富集。短期急性的呼吸暴露SiO₂-NPs,会造成小鼠血管内皮轻微的氧化应激损伤和炎性损伤,但不会造成血管内皮严重的病理性损伤,并且这种血管内皮损伤是由纳米二氧化硅颗粒造成的而不是硅酸盐引起的。第三部分:该部分旨在研究SiO₂-NPs在小鼠体内与体液接触后的复杂行为。由于SiO₂-NPs具有极高的表面能和反应活性,一旦进入机体,就会吸附体液中的一些蛋白质、脂质等生物活性物质,进而形成生物分子-纳米材料复合物,并且构成生物冠的生物分子会发生动态的交换。上面的实验我们证明经呼吸方式暴露的SiO₂-NPs可以破坏气血屏障的结构,并穿过气血屏障直接进入血液循环系统。基于上述结论,本章将在体外模拟体内SiO₂-NPs与体液接触后的复杂行为。在体外,我们把SiO₂-NPs分别与肺表面活性剂（PS）或者小鼠血清（MS）孵育后,通过马尔文粒度仪分析、BCA蛋白定量和考马斯亮蓝染色实验,结果显示SiO₂-NPs会吸附上一些蛋白质,形成蛋白质-纳米材料复合物。通过蛋白质组学分析和免疫印迹实验,我们发现SiO₂-NPs从PS转移到MS中,会发生冠层的交换,特异性的富集载脂蛋白A-I（Apo A-I）。通过圆二色光谱实验,结果发现SiO₂-NPs吸附后会改变Apo A-I的结构。接下来,我们将小鼠通过鼻腔滴注模拟呼吸方式暴露SiO₂-NPs三个月后,Elisa实验结果显示血液中的LDH含量明显升高,同时伴随着血液中的Apo A-I含量显著减少,。综上所述,本章实验证明通过鼻腔暴露的SiO₂-NPs,可以与肺表面活性剂反应形成PS-SiO₂-NPs,穿过气血屏障后,与血液接触后会发生蛋白冠层的交换,特异性富集Apo A-I且对Apo A-I的结构造成破坏,再被机体代谢排出体外,造成血液中Apo A-I含量的降低,进而促进血管内皮的损伤。