嗜水气单胞菌的分离鉴定及控制方法研究

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嗜水气单胞菌感染的主要对象是水产动物性食品,随着人们对水产品消费量的不断增加,其作为致病微生物的地位已被确定,并且日益成为的当前水产品质量与卫生安全关注的重要对象。本文对病死鱼体内嗜水气单胞菌的分离鉴定及其控制方法进行了研究,主要结果如下:1)嗜水气单胞菌的分离鉴定。本实验从自然发病的出血性败血症异育银鲫体内分离得到20株致病菌,经人工回归感染实验证明其具有较大的毒力,在此基础上分析了菌株的生理生化特性,研究了其药敏特性,并通过对典型菌株L1的16S rRNA序列分析构建系统发育树,以期丰富异育银鲫出血性败血症致病菌的病原生物学特性,为异育银鲫细菌性病害的有效防治提供科学理论依据。2)嗜水气单胞菌灭活疫苗的制备。选取嗜水气单胞菌菌株L1为疫苗制作的出发菌株,测定嗜水气单胞菌的OD值和生长曲线,并通过正交实验确定了嗜水气单胞菌L1的最适培养条件为:蛋白胨10g/L,酵母膏15g/L,蔗糖7g/L,K2HPO44.56g/L,同时通过优化得出制作灭活疫苗的条件为:灭活温度28℃,甲醛终浓度0.2%,灭活时间36h。研究结果表明,灭活疫苗的安全性较高,且采用注射接种方式对草鱼的免疫保护率高达90%。3)灭活疫苗对异育银鲫败血症血液和生化指标的影响研究。为研究灭活疫苗对嗜水气单胞菌感染后的异育银鲫的血液和生化指标的影响,将异育银鲫随机分为对照组、感染组和免疫组,在处理后18h和36h时断尾采血,分离得到抗凝血和血清,分别测定8项血液指标和13项与免疫相关的生化指标。处理后18h,感染组与对照组相比,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、Cl-差异显著(P<0.05),其他指标无显著差异(p>0.05),而免疫组与对照组之间均无差异;处理后36h,感染组9项指标(MCH、MCHC、WBC、RBC、Cl-、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、糖)出现极显著差异(p<0.01),8项指标(MCV、HGB、HCT、总蛋白、总胆红素、白蛋白、肌酐、尿酸)差异显著(p<0.05),免疫组指标除WBC显著高于对照组(p<0.05),其他指标均无显著差异(p>0.05)。结果表明,灭活疫苗能够对鱼体产生较强的免疫保护力,有助于减轻致病菌对鱼体的损害程度,增强了鱼体的免疫抵抗力。4)银鲫鱼肠道中益生菌菌株的筛选与血液生化影响分析。通过平板涂布法从健康的银鲫肠道中分离纯化到60株菌株,以嗜水气单胞菌为指示菌,点种法初筛得到12株菌株,再通过牛津杯实验筛选出4株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用(抑菌圈直径在14mm以上)的益生菌疑似株,并进行了耐热试验、耐酸试验和人工肠液耐受试验,筛选出最符合益生菌功能特性的菌株YJ-9。该菌株在90℃高温水浴30min后相对存活率为1.51%,在pH为3的液体培养基中4h内相对存活率为8.37%,活菌数都保持在106CFU/mL以上,并且可以在人工模拟肠液中缓慢生长。在急性毒力实验中,10倍于实验剂量的菌株YJ-9对银鲫无毒,动物保护实验证明菌株YJ-9能有效增强银鲫对嗜水气单胞菌的免疫抵抗力,相对保护率达到80%。研究结果表明,菌株YJ-9可以作为一个新的饲用微生态制剂候选菌种。通过血液指标的测定表明,益生菌可以在鱼受到嗜水气单胞菌感染时有效保护鱼体的肝脏和肾脏,有助于减轻致病菌对鱼体的损害程度,增强了鱼体的免疫抵抗力,但是其防治效果不及疫苗。
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