荧光成像技术因其能够进行可视化、高灵敏、实时信号反馈等优势,被广泛应用于生物医学成像研究。近红外荧光染料的发射波长较长（650-900 nm）,具有较低的背景干扰、较好的组织穿透能力、较小的光损伤等亮点促进了探针在生物医学方面的应用,但是目前所报道的近红外荧光探针存在光稳定性差、斯托克斯位移小、成像信号单一等问题,基于此,本论文主要围绕着生物活性分子的检测设计开发了一系列近红外荧光探针,经过对其光谱特性进行考察,得到三种性能优良的近红外比率型荧光探针,分别应用于过氧亚硝酸根（ONOO-）、半胱氨酸（Cys）、pH的特异性检测与生物成像,具体内容如下:（1）基于ONOO-检测设计合成了两种近红外比率型荧光探针,选用半花菁结构为染料的主要结构骨架,引入了二氰基异佛尔酮衍生结构,得到两种不同取代基的荧光探针DCN-Cy-OH和DCN-Cy-OMe,其中探针DCN-Cy-OMe对ONOO-表现出更好的特异性识别能力。探针被ONOO-氧化裂解导致π共轭体系被破环,伴随着发射峰从715 nm蓝移至565 nm和670 nm。探针具有较大斯托克斯位移（175 nm）,其荧光强度比值与ONOO-在1到20μM内具有很好的线性关系,检出限为0.71μM,并已成功用于细胞中ONOO-的比率荧光成像,且探针能够评估利福平增强异烟肼肝损伤产生的ONOO-。（2）基于Cys的选择性检测设计合成了一种新型的近红外比率型荧光探针,选用近红外荧光染料DCN-Cy-OH为荧光团,丙烯酰氯为半胱氨酸的特异性识别位点。探针具有较大发射波长位移（147 nm）,较短的响应时间,其荧光强度比值与Cys在1到30μM内具有很好的线性关系,检出限为0.41μM。探针被成功应用于细胞中Cys的成像分析,并进一步通过光声成像检测生物体内正常组织与癌变组织内半胱氨酸水平的变化。（3）基于pH检测设计合成了一种“自校正”比率荧光探针Cy-Cl-OH,以花菁结构作为探针信号表达的荧光团,通过质子化触发吲哚烷环的开环,从而导致π共轭的扩展促进了荧光团中的分子内电荷转移（ICT）过程,导致642 nm发射峰信号减弱,而在818 nm处的发射峰信号不发生变化,作为内参比信号,从而实现对pH的“自校正”响应。探针在pH=4.5～7.5范围内,荧光强度比值与pH具有很好的线性关系,经计算得探针p Ka值为6.2,并具有较好灵敏度和光稳定性,已成功用于细胞内不同pH的荧光成像。