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研究背景氨苯砜（dapsone,DDS）于1908年被首次合成,因其具有抗菌和抗炎的双重作用,已被广泛应用于感染性疾病及炎症性疾病的治疗,前者包括麻风、疟疾、卡氏肺囊虫肺炎等,后者包括疱疹样皮炎、脓疱型银屑病、慢性荨麻疹等。在治疗过程中,DDS可引起消化系统、皮肤等方面的不良反应,其中最为严重的是氨苯砜超敏反应综合征（dapsone hypersensitivity syndrome,DHS）。0.5%-3.6%的患者在服用DDS 4-6周后,会出现DHS,主要表现为发热、皮疹、肝功能异常及淋巴结肿大等,死亡率约为9.9%。氨苯砜超敏反应综合征的发生危及患者的用药安全,也限制了 DDS在临床的广泛应用。随着全基因组关联研究（genome wide association studies,GWAS）的发展,我们课题组前期通过分析发现人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-B*13:01（P=6.84×10-25,OR=20.53）为DHS的风险位点,这一结果也在泰国、印度、印度尼西亚等国家得到验证。同时,我们课题组利用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,qPCR）技术成功研发针对HLA-B*13:01的DHS风险位点检测试剂盒,并在全国开展新发麻风患者疗前HLA-B*13:01检测预防DHS的临床应用研究,共对1,539例新发麻风患者进行筛查,对携带HLA-B*13:01风险位点的患者,建议避免服用DDS,而在1,239例不携带HLA-B*13:01且接受DDS治疗的患者中,未有DHS的发生。通过此研究,将DHS的发生率在我国麻风患者中降为0。然而,并不是全部HLA-B*13:01（+）的患者在服用DDS后都会发生DHS,研究发现,HLA-B*13:01的阴性预测值为99.8%,但阳性预测值仅为7.8%。对HLA-B*13:01（+）的患者避免使用DDS,固然可以预防DHS的发生,但也会致部分患者不能从DDS治疗中获益。因此,仍需对其他参与调控DHS发生的因素如机体的免疫反应等进行深入的研究,这对于DHS的精准预防、DDS安全合理应用具有重要意义。既往研究证实,药物超敏反应的发生机制主要有三种理论:半抗原理论、p-i理论、肽谱改变学说。研究发现,氟氯西林可形成药物-蛋白加合物,通过半抗原机制致T细胞的活化;卡马西平可以直接与HLA分子及T细胞受体结合而不需要抗原递呈细胞（antigen presenting cell,APC）对药物的摄取及加工;阿巴卡韦可导致已与HLA-B*57:01结合的肽的构象发生改变引起超敏反应的发生。目前研究发现,在DDS的刺激下,DHS患者的外周血单一核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）可以分泌颗粒溶素;此外,利用健康志愿者的PBMC,去除调节性T细胞后,幼稚CD4+/CD8+T细胞可被DDS及其代谢产物亚硝基氨苯砜（nitrosodapsone,DDS-NO）激活,但仍存在下述问题有待进一步研究:第一,氨苯砜特异性T细胞的活化机制尚未明确;第二,氨苯砜代谢产物DDS-NO在超敏反应发生中的作用尚不清楚。因此,本研究的目的是:第一,明确DHS患者体内是否存在DDS/DDS-NO特异性的CD4+/CD8+T细胞;第二,探究DDS/DDS-NO特异性T细胞的表型及活化机制;第三,分析HLA-B*13:01在DDS/DDS-NO特异性T细胞激活中的作用。第一部分 氨苯砜超敏反应综合征特异性T细胞表型特征分析及活化机制研究方法共收集6名DHS患者的PBMC,利用DDS、DDS-NO、利福平及氯苯吩嗪进行淋巴细胞转化实验及IFN-γ ELISpot实验。通过梯度稀释法对3名患者的PBMC在体外制备DDS/DDS-NO特异性T细胞克隆。利用[3H]-胸腺嘧啶对DDS/DDS-NO或与DDS结构相似的化合物刺激下的细胞增殖进行检测,利用流式细胞术对DDS/DDS-NO特异性T细胞的表型、T细胞受体及细胞因子受体进行分析,并利用ELISpot实验对DDS/DDS-NO特异性T细胞的细胞因子的释放进行测定。在实验体系中加入主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）抗体对DDS/DDS-NO特异性T细胞的HLA分子的限制性进行研究。然后,分别将APC用戊二醛进行固定或预先将APC与DDS/DDS-NO进行孵育来探究抗原加工递呈机制。通过加入谷胱甘肽阻断DDS-NO与蛋白的结合,并利用质谱法对DDS-NO的稳定性进行分析。结果通过梯度稀释法共得到2708株T细胞克隆,其中药物特异性T细胞克隆为794株,包括DDS特异性T细胞克隆395株,DDS-NO特异性T细胞克隆399株。80%的DDS特异性T细胞及78%的DDS-NO特异性的T细胞克隆为CD4+T细胞。在DDS/DDS-NO的刺激下,T细胞克隆可发生增殖反应,并具有浓度梯度依赖性。大部分DDS特异性T细胞克隆为DDS特异性,而大部分DDS-NO特异性的T细胞克隆可与DDS发生交叉反应,并与羟胺氨苯砜发生交叉反应。DDS/DDS-NO特异性的CD4+T细胞为HLA Ⅱ类分子限制性的,而DDS/DDS-NO特异性的CD8+T细胞为HLA Ⅰ类分子限制性的。所有的T细胞克隆在DDS/DDS-NO的刺激下可分泌IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-22、穿孔素、颗粒酶B及FasL,而不分泌IL-17。DDS/DDS-NO特异性的CD4+T细胞克隆可高表达CCR4及CXCR3,DDS/DDS-NO特异性CD8+T细胞克隆高表达CCR6、CCR9以及CCR10。DDS/DDS-NO特异性T细胞克隆可表达不同的TCR受体。DDS/DDS-NO特异性CD4+T细胞克隆或CD8+T细胞克隆的激活需要APC的抗原加工递呈作用。DDS-NO特异性的CD4+/CD8+T细胞克隆在预先与DDS-NO孵育0.5h、2h、4h的APC的刺激下可发生增殖反应,但这种增殖反应在加入谷胱甘肽后被阻断。相反,DDS特异性的CD4+/CD8+T细胞在预先与DDS孵育的APC的刺激下不能发生增殖反应,在实验体系中加入谷胱甘肽也不会阻断DDS诱导的T细胞克隆的增殖反应及细胞因子的释放。DDS特异性T细胞克隆与戊二醛固定的APC及DDS共同培养,可发生增殖反应,这提示DDS可以与HLA分子直接结合激活T细胞。而DDS-NO特异性T细胞克隆在与戊二醛固定的APC及DDS-NO共同培养的体系中,不会发生增殖反应,据此推测DDS-NO需要APC对其进行加工处理后递呈给T细胞克隆。结论研究表明在DHS患者体内存在DDS/DDS-NO特异性的CD4+/CD8+T细胞,且这些特异性的T细胞参与DHS的发生。DDS可直接与HLA分子结合,这种结合是可逆的;而DDS-NO与HLA分子的结合是不可逆的。第二部分氨苯砜超敏反应综合征特异性CD8+T细胞HLA分子限制性研究方法利用淋巴细胞转化实验对新收集的4名DHS患者的PBMC进行检测。通过梯度稀释法对3名患者的PBMC在体外制备DDS/DDS-NO特异性的CD8+T细胞克隆。通过[3H]-胸腺嘧啶对DDS/DDS-NO特异性的CD8+T细胞克隆的增殖反应进行检测,并在实验体系中加入MHC抗体对T细胞克隆的HLA分子限制性进行初步研究。为了进一步探究HLA-B*13:01在DDS/DDS-NO特异性CD8+T细胞活化中的作用,制备C1R-B*13:01细胞系,并将DDS/DDS-NO特异性的T细胞与C1R-B*13:01细胞系及DDS或DDS-NO共同培养,通过IFN-γ ELISpot对细胞因子的释放进行检测。结果通过梯度稀释法共得到CD8+T细胞克隆449株,其中药物特异性CD8+T细胞克隆141株,包括DDS特异性CD8+T细胞克隆91株及DDS-NO特异性CD8+T细胞克隆50株。DDS/DDS-NO特异性的CD8+T细胞在DDS或DDS-NO的刺激下发生增殖反应,且均为HLA Ⅰ类分子限制性的。DDS/DDS-NO特异性的T细胞克隆仅在同源性APC或表达HLA-B*13:01分子的APC及DDS或DDS-NO的刺激下发生增殖反应。结论研究证实DDS/DDS-NO特异性的CD8+T细胞在与表达HLA-B*13:01分子的抗原递呈细胞及DDS或DDS-NO的共同培养时被激活。第三部分MHC Ⅱ类分子限制性CD8+T细胞研究方法通过梯度稀释法对HLA-B*13:01（+）的DHS患者的PBMC在体外制备DDS-NO特异性的CD8+T细胞克隆。通过流式细胞术对T细胞克隆的表型、T细胞受体及细胞因子受体进行分析。利用[3H]-胸腺嘧啶对DDS或DDS-NO刺激下的细胞增殖反应进行检测。通过ELISpot对细胞因子的释放进行测定。利用铬释放实验对药物刺激下T细胞克隆对靶细胞的杀伤作用进行检测。分别通过在实验体系中加入MHC抗体、利用戊二醛固定的APC或预先与DDS-NO孵育的APC进行实验,对T细胞克隆的活化机制进行研究。结果共挑选8株DDS-NO特异性的CD8+T细胞克隆,这8株克隆均可在DDS-NO的刺激下发生增殖反应,其中4株与DDS存在交叉反应。MHC抗体阻断实验发现其中5株为HLA Ⅰ类分子限制性的,3株为HLA Ⅱ类分子限制性的。结合交叉反应实验结果,3株HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆均不与DDS存在交叉反应。8株克隆均通过半抗原理论被激活。通过进一步抗体阻断实验证明,HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞的活化是由DDS-NO与HLA-DP分子结合所诱导的。HLA Ⅱ类分子限制的CD8+T细胞克隆为效应记忆细胞（CD45RO+CD28+PD-1+CTLA-4+）,且均可表达 TCRVβ 21.3。HLA Ⅱ 类分子限制的CD8+T细胞克隆高表达CCR4及CXCR3。在DDS-NO的刺激下,HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆与HLA Ⅰ类分子限制性的CD8+T细胞克隆均可分泌IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B及FasL。然而,通过铬释放实验表明在DDS-NO的刺激下,HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆对靶细胞的裂解能力弱于HLA Ⅰ类分子限制性的CD8+T细胞克隆。结论通过本部分研究发现,在DHS患者体内存在HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆,这表明HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆与HLA Ⅰ类分子限制性的CD8+T细胞克隆共同参与DHS的发生机制。在细胞增殖反应、细胞因子的释放、T细胞活化机制等方面,HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆与HLA Ⅰ类分子限制性的CD8+T细胞克隆是相似的。下一步应对DDS-NO与HLA分子的相互作用进行研究从而明确HLA Ⅱ类分子限制性的CD8+T细胞克隆的作用机制。