研究背景:糖尿病（Diabetes mellitus,DM）已成为世界第三大疾病,其发病率和对人类健康的危险性仅次于癌症和心脑血管疾病。其中脂类代谢异常（如游离脂肪酸）在2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）的发病机制中具有重要作用,同时2型糖尿病也是一种低度炎症性疾病。胰岛素抵抗过程中的炎性反应常引起机体异常炎症因子的产生、急性期反应蛋白的增加以及炎症信号转导通路的激活。单核/巨噬细胞作为先天性免疫和适应性免疫的重要参与者,可通过分泌细胞因子及抗原提呈等作用影响并调控免疫炎症反应的进程。在炎症状态下,三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）可从应激细胞或死亡细胞中被动地释放到细胞外,它通过与细胞膜上的相关嘌呤受体亚型（如P2X₇受体）结合发挥不同的生理作用。P2X₇受体是以ATP为配体的非选择性阳离子门控通道,在多种炎性病理状态下表达上调进而影响炎性介质的释放,参与炎性和免疫反应,诱导细胞损伤或凋亡等过程。长链非编码核糖核酸（long non-coding RNAs,lnc RNAs）一般是指长度超过200个核苷酸、位于细胞核或胞浆内、缺乏编码蛋白质的能力、以RNA形式在表观遗传水平、转录水平及转录后水平调控基因表达的一种RNA。lncRNAs具有重要的生理学功能并参与某些疾病的病理变化过程。Uc.48+的长度为298bp,属长链非编码RNA。研究证实在非糖尿病人群中,C反应蛋白（C reactive protein,CRP）水平可以预测2型糖尿病的发病,且其不受肥胖、脂肪分布和胰岛素抵抗等因素的影响;同时CRP直接参与了炎症及动脉粥样硬化等心血管疾病,也是2型糖尿病并发的冠心病最强有力的预示因子与危险因子。脂类代谢异常可造成脂质沉积或脂毒性而引起β细胞功能紊乱。虽然正常的脂肪酸（如磷脂）具有维持细胞膜完整性的作用,但如果游离脂肪酸浓度异常增加可诱导多种信号途径（内质网应激、活性氧、凋亡、炎症途径等）功能异常出现脂毒性损伤。在炎症状态下,外周单核细胞进入组织分化形成巨噬细胞。巨噬细胞可通过释放一系列的生长因子和细胞因子而召集其它细胞（如纤维细胞、内皮细胞等）影响相关组织的功能。2型糖尿病患者可诱导巨噬细胞产生炎性因子激活补体,同时诱导内皮细胞产生黏附因子,使内皮功能受损,加速炎性反应过程。P2X₇受体广泛表达于各种免疫细胞（如单核细胞、巨噬细胞、NK细胞等）中,P2X₇受体激活后可增加免疫细胞分泌的炎性因子进而促进炎症反应的发生,同时可以调节b细胞及t细胞功能来调控免疫反应。本研究第一部分将通过观察在高糖高脂处理下,p2x7受体介导的thp-1源性巨噬细胞炎症反应相关因子的改变,探讨其在免疫炎症反应中的作用及可能机制。在2型糖尿病的发生发展过程中,巨噬细胞的炎症反应与脂质代谢具有相互协同的特点,炎症可导致脂质代谢紊乱,脂质代谢异常也可诱导炎症的发生。研究表明巨噬细胞在炎症反应到组织修复转换中扮演重要角色,可决定受伤部位的最终命运。lncrnas具有组织特异性,在多种组织中均可表达,细胞分泌的lncrnas常表现为疾病、组织、发展阶段等多方面特异性,此特征可使其成为生物标记物或治疗靶点。lncrnas表达异常与一些疾病的病理变化有关。本实验观察到高糖高脂处理导致巨噬细胞uc.48+表达上调,提示uc.48+涉及相关病理变化。目前尚未见uc.48+在单核巨噬细胞的研究报道。因此,本项研究第二部分将应用lncrnauc.48+sirna对高糖高脂处理下raw264.7巨噬细胞p2x7受体介导的糖尿病炎性病理损伤的影响,探讨uc.48+在2型糖尿病巨噬细胞p2x7受体介导免疫炎症反应中的作用及可能机制。2型糖尿病状态下,巨噬细胞的浸润造成脂肪组织、肝脏、肌肉及胰腺均处于炎症状态。研究表明组织中的巨噬细胞状态对2型糖尿病的发生及进展均具有关键性的调控作用。另一方面,特定组织中异常的lncrnas表达可造成人体生物学功能紊乱从而引发各种疾病,如lncrnas可能参与了胰岛素的代谢效应及胰岛素抵抗的发展过程。本项研究第三部分将观察lncrnauc.48+sirna对2型糖尿病模型小鼠血糖血压及神经病理变化的影响及其对p2x7受体介导的腹腔巨噬细胞病理变化的影响,探讨uc.48+在2型糖尿病小鼠及其腹腔巨噬细胞病理变化中的作用。目的:1、观察2型糖尿病crp正常组、2型糖尿病crp升高组、正常对照组3组人群的临床检测指标、外周血单核细胞p2x7受体表达的差异。通过观察在高糖高脂处理下,p2x7受体介导的thp-1源性巨噬细胞炎症反应相关因子的改变,探讨其在免疫炎症反应中的作用及可能机制。2、观察2型糖尿病crp正常组、2型糖尿病crp升高组、正常对照组3组人群血清uc.48+及细胞因子的变化。通过观察lncrnauc.48+小干扰rna在高糖高脂处理下raw264.7巨噬细胞p2x7受体介导炎性变化中的作用,探讨uc.48+小干扰rna对p2x7受体介导的免疫炎症反应的作用及可能机制。3、通过观察uc.48+sirna对2型糖尿病模型小鼠及其腹腔巨噬细胞病理变化的影响,探讨uc.48+在2型糖尿病小鼠及p2x7受体介导的腹腔巨噬细胞炎性损伤中的作用。方法:1、选取2型糖尿病crp正常组、2型糖尿病crp升高组、正常对照组3组人群;临床血样检测项目包括空腹血糖（fpg）、餐后血糖（ppg）、总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）、低密度脂蛋白（ldl）、高密度脂蛋白（hdl）、糖化血清蛋白（gsp）、空腹胰岛素（fpi）;收集受检者的edta抗凝血并通过流式细胞仪检测外周血单核细胞p2x7受体的表达。统计分析比较上述数据在3组人群中的差异。通过mts检测方法确定thp-1源性巨噬细胞的高糖高脂处理浓度;p2x7受体小干扰rna（sirna）干扰高糖高脂处理下的thp-1源性巨噬细胞,通过逆转录-聚合酶链式反应（rt-pcr）方法和蛋白印迹方法分别检测p2x7受体mrna和蛋白的表达;通过荧光探针检测细胞内活性氧及钙浓度;采用酶联免疫吸附法（elisa）测定培养上清液细胞因子的含量,包括肿瘤坏死因子α（tnf-α）、白介素-10（il-10）、白介素-1β（il-1β）;蛋白印迹法检测erk信号通路的改变。2、采用酶联免疫吸附法（elisa）测定2型糖尿病crp正常组、2型糖尿病crp升高组、正常对照组3组人群血清细胞因子的含量,包括肿瘤坏死因子α（tnf-α）、白介素-10（il-10）、白介素-1β（il-1β）;采用逆转录-聚合酶链式反应检测血清中uc.48+的表达;uc.48+小干扰rna（sirna）干扰高糖高脂处理下的raw264.7细胞,通过rt-pcr方法检测uc.48+的表达、p2x7受体mrna的表达;蛋白印迹法检测p2x7受体蛋白及erk信号通路的改变。通过荧光探针检测细胞内活性氧及钙浓度;采用酶联免疫吸附法（elisa）测定培养上清液细胞因子的含量,包括肿瘤坏死因子α（tnf-α）、白介素-10（il-10）、白介素-1β（il-1β）;通过mts试验和流式细胞仪分别检测细胞增殖活性和细胞凋亡水平。3、高糖高脂饲料喂养联合小剂量stz腹腔注射诱导2型糖尿病小鼠模型,血糖检测确定2型糖尿病小鼠模型是否成功建模;uc.48+小干扰rna腹腔皮下注射后,检测小鼠血清中的血脂和细胞因子浓度,检测小鼠的血压和心率、机械痛敏阈值和热痛敏阈值;获取并鉴定小鼠腹腔巨噬细胞后,通过calcein-am和yo-pro染料检测p2x7受体通道的形成;通过rt-pcr方法检测uc.48+的表达、p2x7受体mrna的表达;蛋白印迹法检测p2x7受体蛋白及erk信号通路的改变。结果:1、2型糖尿病组在空腹血糖、餐后血糖、糖化血清蛋白、稳态模型评估胰岛素抵抗指数及甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白均明显高于正常对照组,而2型糖尿病crp升高组在crp、空腹胰岛素、稳态模型评估胰岛素抵抗指数及糖化血清蛋白均明显高于其他2组。2型糖尿病crp升高组单核细胞p2x7受体的表达明显高于2型糖尿病crp正常组和正常对照组。通过mts试验确定高糖高脂处理thp-1巨噬细胞的浓度为44.4mm葡萄糖合并1.0mm游离脂肪酸;高糖高脂处理后thp-1巨噬细胞p2x7受体的mrna及蛋白表达较对照组显著增加;p2x7sirna转染可显著抑制p2x7mrna及蛋白的表达。p2x7sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的thp-1巨噬细胞内活性氧及钙浓度;p2x7sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的thp-1巨噬细胞tnf-α、il-1β含量,p2x7sirna转染可显著提高因高糖高脂处理而降低的il-10浓度;p2x7sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的thp-1巨噬细胞p-erk1/2的蛋白激活水平。2、2型糖尿病患者的tnf-α、il-1β的水平明显高于正常对照组,同时tnf-α及il-1β的水平在2型糖尿病crp升高组明显高于2型糖尿病crp正常组;il-10在2型糖尿病crp升高组的水平显著低于其他2组。2型糖尿病患者血清uc.48+的表达水平较正常对照组显著增加,uc.48+在2型糖尿病crp升高组的表达明显高于2型糖尿病crp正常组。uc.48+sirna处理降低了高糖高脂诱导下raw264.7细胞uc.48+的表达;uc.48+sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的raw264.7细胞p2x7受体mrna和蛋白的表达。uc.48+sirna转染可显著提高因高糖高脂处理而降低的raw264.7细胞增殖水平,uc.48+sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的raw264.7细胞凋亡水平。uc.48+sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的raw264.7细胞内活性氧及钙浓度。uc.48+sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的raw264.7细胞tnf-α、il-1β含量,uc.48+sirna转染可显著提高因高糖高脂处理而降低的il-10浓度;uc.48+sirna转染可显著降低因高糖高脂处理而升高的raw264.7细胞p-erk1/2的蛋白激活水平。3、高糖高脂饲料喂养联合小剂量stz腹腔注射诱导2型糖尿病小鼠模型,小鼠空腹血糖及餐后血糖均较对照组显著升高,提示2型糖尿病模型制作成功;给予uc.48+sirna注射后其空腹血糖及餐后血糖均较模型组显著下降。模型组、小干扰对照组及uc.48+小干扰组的血脂较对照组显著增加,但模型组、小干扰对照组及uc.48+小干扰组之间血脂比较无显著性差异;模型组小鼠较对照组的机械缩足反射阈值及热缩足反射阈值均明显降低,给予uc.48+sirna注射后,其机械缩足反射阈值及热缩足反射阈值均较模型组反射阈值显著增加;模型组的小鼠心率较对照组显著增加,但给予uc.48+sirna注射后,模型组、干扰对照组及uc.48+小干扰组之间心率比较无显著性差异;模型组的小鼠收缩压及舒张压均较对照组显著增加,给予uc.48+sirna注射后,其收缩压及舒张压均较模型组显著下降;模型组tnf-α、il-1β的含量较正常组显著增加,而uc.48+sirna注射后,其tnf-α、il-1β的浓度显著下降;模型组il-10浓度较正常组明显降低,而uc.48+sirna注射后,其il-10浓度显著升高。模型组小鼠腹腔巨噬细胞p2x7受体离子通道的形成、p2x7的mrna及蛋白表达及p-erk1/2的蛋白激活水平均明显高于对照组;而uc.48+sirna注射后可显著降低p2x7受体离子通道的形成、p2x7的mrna及蛋白表达及p-erk1/2的蛋白激活水平。结论:1、2型糖尿病crp升高组外周血单核细胞的p2x7受体的表达升高可能与胰岛素抵抗的形成有关。高糖高脂作用thp-1源性巨噬细胞,其p2x7受体的表达、炎症因子的释放及p-erk信号通路的激活均可出现上调,而降低p2x7受体的表达,可抑制或改善其介导的炎症状态,揭示p2x7受体可调控thp-1源性巨噬细胞的炎症反应。2、2型糖尿病crp升高组患者处于免疫炎症状态,其血清uc.48+的表达、crp含量及炎症因子水平增加。高糖高脂刺激raw264.7细胞uc.48+表达增加,并可导致多种途径（如分泌细胞因子、产生活性氧、激活erk信号通路等）功能异常,而uc.48+小干扰rna可降低raw264.7细胞p2x7受体的上调表达,进而影响p2x7受体介导的免疫炎症反应。3、2型糖尿病小鼠腹腔巨噬细胞uc.48+的表达增加,uc.48+小干扰rna影响2型糖尿病小鼠血糖血压及神经病理变化,降低2型糖尿病小鼠腹腔巨噬细胞p2x7受体的上调表达,并对2型糖尿病小鼠腹腔巨噬细胞p2x7受体介导的炎性反应、氧化应激反应及erk信号通路具有调控作用,提示uc.48+通过下调p2x7受体表达影响2型糖尿病小鼠血糖血压、神经病理变化及腹腔巨噬细胞炎性反应。