研究背景癫痫是神经系统重大疾病,致病原因复杂繁多,但都与大脑神经元异常放电引发的短暂性功能障碍密切相关。目前,全球癫痫患者超过7000万,治疗方案以尽快控制发作、减少神经损伤为主,但存在副作用大及易耐药等问题,约20%～25%的患者因药物抵抗最终形成难治性癫痫。癫痫的反复发作会加重神经元的损伤,造成神经干细胞过度修复,同时也导致神经异位修复并造成异常神经环路,进而形成局灶性癫痫或广泛性癫痫发作。中医辨治或结合西药的应用疗效证据充分,副作用小,但往往将它的作用机制归结于多成分多靶点,由于缺乏对核心作用靶点的鉴定方法,难以确定起效环节、阐明其确切的分子机制,影响了中药的科学评价与开发利用。靶点的发现和确定是构建化学成分与药效作用相关性的关键。中药药效组分复杂,传统的靶点筛选方法有所局限,靶点发现已成为中医药作用机制研究的瓶颈。在前期数据挖掘中发现:莪术、郁金、石菖蒲等化痰类药物,在治疗癫痫中被频繁应用,这些药物均含有目前被广泛报道对癫痫具有较好疗效的姜黄素。姜黄素是多酚类化合物,多项研究结果表明其具有较高的安全性,并且在炎症性疾病、肿瘤、神经系统性疾病以及急慢性癫痫的治疗中显示出较好的疗效,但其发挥功效作用的靶点及确切机制还不清楚。为了深入探讨姜黄素抑制异常神经发生的分子机制,在公共数据库数据获取法的基础上,实验综合亲和层析法（Affinity Chromatography）、药物亲和反应靶标稳定性鉴定技术（Drug Affinity Responsive Target Stability,DARTS）等生物化学方法以及蛋白质组学技术对候选靶蛋白进行了筛选鉴定,利用生物信息学对关键通路进行了分析,以期探索姜黄素在癫痫治疗所发挥的作用以及可能的靶点和通路。研究目的利用药物亲和反应靶标稳定性鉴定技术与亲和层析法,分析姜黄素在癫痫病理进程中抑制癫痫发作异常神经发生的关键靶点及可能通路,建立姜黄素作用癫痫关键靶点的筛选方法,探索可能的分子机制。研究方法1选择小鼠品系建立癫痫小鼠模型。为模拟癫痫反复发作的病理状态,通过比对戊四唑和匹罗卡品药物致痫机理,评估小鼠癫痫易感性,最终选择造模条件为:ICR小鼠,在腹腔注射匹罗卡品（290 mg/kg）前30 min腹腔注射东莨菪碱（1.5mg/kg）。小鼠在癫痫持续状态（Status Epilepticus,SE）达2h,给予腹腔注射地西泮（10 mg/kg）终止癫痫。2采用中药组方拆减配伍,将不同组方用于治疗癫痫小鼠,通过观察小鼠癫痫发作程度来评判癫痫发作等级。采用经心脏灌流方式取材,通过免疫荧光染色,从病理组织上评价不同组方间的疗效。3采用公共数据库获取并筛选癫痫的疾病靶点和姜黄素的药物靶点,通过数据预处理,分析构建姜黄素-癫痫疾病靶点-核心通路网络关系。4采用亲和层析法,将姜黄素与环氧活化琼脂糖凝胶6B偶联并作为固定相,捕获姜黄素的靶蛋白,通过银染检测梯度洗脱的蛋白样品,确定制样成功后,进行质谱鉴定。5采用DARTS技术,利用小分子和蛋白结合后,蛋白折叠的稳定性增加,具有抗蛋白酶水解的原理,通过考马斯亮蓝染色筛选差异性蛋白,切胶进行质谱分析。6对获取的靶点通过蛋白质组学、生物信息学整合分析,探讨姜黄素作用癫痫的核心靶点,并对上述方法进行比较。研究结果1明确了姜黄素作为郁金的有效作用成分,是龙牡白金组方发挥药效作用的主要成分。实验对龙牡白金组方进行拆解,具体分为龙牡白金组（LMBJ）:由生龙齿、生牡蛎、生白矾、郁金组成;龙牡白金去郁金组（LMB）:由生龙齿、生牡蛎、生白矾组成;白金组（BJ）:生白矾、郁金组成;白矾组（B）:单味生白矾;姜黄素纳米制剂组（nano-Cur）。经过免疫荧光染色对比发现龙牡白金去郁金组（LMB）与白矾组（B）和模型空白对照组（MOD）一样,均无治疗作用。龙牡白金组（LMBJ）、白金组（BJ）和姜黄素纳米制剂组（nano-Cur）均可以抑制癫痫异常神经发生,但白金组（BJ）可能存在某种毒副作用,小鼠生存率明显低于其他组。因此实验确定了姜黄素作为郁金的有效作用成分,是龙牡白金组方发挥药效作用的主要成分。2利用公共数据库数据获取法（以下称网络药理学）预测潜在作用靶点440个,核心靶点51个,涉及GO生物过程494条,KEGG信号通路133条。GO和KEGG结果分析主要集中在兴奋性神经能和抑制神经能上,大部分是围绕突触信号传递的结果（图3.1.3）。分析原因可能为,数据来自于数据库公开发表数据,这往往能反映出大多学者对癫痫疾病研究的热点在兴奋性和抑制性神经元失衡的假说中,基于公共数据的网络药理学的缺点在于实验结果集中偏向某一研究方向,难以提出创新性观点和发现新机制。3利用亲和层析法筛选核心靶点73个,涉及GO生物过程191条,KEGG信号通路50条。为了探究姜黄素在癫痫治疗中新的作用靶点及通路,本研究利用亲和层析法通过质谱分析得到对照组164个蛋白质,姜黄素组116个蛋白质,两组共有蛋白55个。将共有蛋白质中PSMs值大于1.5倍对照组的蛋白质12个和姜黄素组特有的蛋白质61个（合计73个）,进行富集分析获得了姜黄素治疗癫痫可能参与的细胞组成（CC）35条注释、分子功能（MF）25条注释、生物学过程（BP）131条注释,KEGG信号通路富集分析共获得50条注释（图3.2.3）。分析结果较网络药理学多样,除了突触信号传递失衡外,涉及有神经营养因子信号转导通路（Neurotrophin Signaling Pathway）、丙酮酸代谢过程（Pyruvate Metabolic Process）、骨架蛋白结合（Scaffold Protein Binding）等。4利用DARTS筛选核心靶点212个,涉及GO生物过程214条,KEGG信号通路46条。为了获取相对真实的、公正的、可靠的实验数据,弥补亲和层析法实验的一些缺点,本研究利用DARTS技术,通过质谱分析得到对照组717个蛋白质,姜黄素组700个蛋白质,两组共有618个蛋白质,实验将两组共有蛋白质中MS/MS 比值大于1.5倍对照组的蛋白质130个和姜黄素组特有的蛋白质82个（合计212个）进行富集分析,涉及GO生物过程214条,KEGG信号通路46条。GO和KEGG结果分析结果主要集中在细胞能量代谢相关的细胞运动与粘附等作用（图3.3.3）。5将利用亲和层析法与DARTS技术两种方法所获得的关键通路下富集的蛋白质进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,结合专家研讨进行综合研判获得Laminin、Mapk3、Pik3cb、Pdpk1、Pik3c3、Acan、Ncan、Hapln1、Crk、Mapk1 0、Rps6ka2、Pebp1、Ppp2r1aA关键靶点14个,进而进行文献深度学习与分析,确定Laminin是胞外基质关键表征蛋白之一,进一步采用免疫荧光染色的方法验证了其在神经发生中的作用。研究结论1建立了药物致痫小鼠模型,对癫痫促效方主药郁金的重要药效成分姜黄素在癫痫小鼠海马神经元异常神经发生中的作用进行了深入研究,发现姜黄素为癫痫促效方重要核心药效成分,对癫痫后大脑异常神经发生具有抑制作用。2利用DARTS技术与亲和层析法,对姜黄素抑制癫痫后异常神经发生的核心作用靶点进行了鉴定。所得数据通过GO和KEGG富集分析、蛋白质与蛋白质相互网络（PPI）等进行解析,并通过免疫荧光染色实验验证,发现胞外基质蛋白复合体为姜黄素的作用核心靶点。