论文部分内容阅读
小麦成熟期遇雨发生穗发芽是世界性自然灾害,不仅影响产量而且影响品质。本研究以抗/感穗发芽小麦品种’淮麦0360’和’中优9507’为材料,克隆了抗穗发芽相关基因TaFUS3和TaLEC1的全长,分析了这两个基因的组织表达特性及在小麦种子发育过程中、成熟期离体胚萌发过程中以及在高盐(NaCl)、甘露醇、高温和ABA处理下的表达情况,构建了 和TaLEC1过表达和RNAi抑制表达载体并用农杆菌介导法转入小麦中,探索该基因的功能。主要研究结果如下:1、采用RT-PCR结合RACE技术克隆了小麦休眠相关基因2个。序列分析显示,克隆基因TaFUS3的cDNA片段为1018 bp,编码区为906 bp,5’-非编码区有47 bp,3’-非编码区有65 bp,推测编码蛋白的分子量为33.76kD,由301个氨基酸组成。基因组序列分析显示,TaFUS3基因包含7个外显子和6个内含子。TaLEC1基因的cDNA片段长度为1074 bp,编码区为741 bp,其中5’-非编码区23 bp,3’-非编码区310 bp,推测编码蛋白由246个氨基酸组成,分子量为26.22kD。基因组序列与cDNA序列比对发现,TaLEC1基因没有内含子。2、利用荧光定量RT-PCR分析了克隆基因的时空表达和在种子发育以及萌发过程中的表达特性,结果表明,TaFUS3主要在花后25 d的胚中表达,而TaLEC1主要在发芽10 d的叶中表达。种子发育过程中,TaFUS3基因在小麦抗/感穗发芽品种中的表达趋势基本一致,表达量均呈单峰曲线变化。在整个种子发育过程中,TaFUS3基因在抗穗发芽品种’淮麦0360’中的相对表达量均高于感穗发芽品 ’中优9507’,而TaLEC1在感穗发芽品种’中优9507’中的相对表达量高于抗穗发芽品种’淮麦0360’,且主要在籽粒发育前期表达,种子成熟前表达量下降。花后35 d离体胚萌发过程中的表达特性分析显示,TaFUS3基因在抗/感穗发芽品种中表达量均较对照(0d)显著上调。在处理的第2 d,TaFUS3基因在抗穗发芽品种’淮麦0360’中表达量显著高于感穗发芽品种’中优9507’,TaLEC1基因虽然在抗穗发芽品种’淮麦0360’中的表达量有所上调但差异不显著。3、分析了种子萌发相关标志基因α-AMY1、Em1和Em6在种子发育过程中的表达特性,结果表明,这三个基因在种子发育前期表达量均较低且在抗/感穗发芽品种中没有差异,差异主要体现在种子发育后期即花后20～35 d,α-AWY1在感穗发芽品种’中优9507’中的表达量显著高于抗穗发芽品种’淮麦0360’,Em1和Em6均在抗穗发芽品种’淮麦0360’中的表达量显著高于敏感品种’中优9507’。由此推测TaFUS3基因可能通过正向调控Em1和Em6表达,负向调控α-AMY1表达来参与种子休眠调控过程。4、分析了克隆基因在种子萌发过程中高盐、甘露醇、高温及ABA处理下的表达特性,结果表明,在各种胁迫处理下,TaFUS3基因在中优9507和淮麦0360中的表达量均表现为上调表达,TaLEC1基因在胁迫处理的初期为上调表达,之后迅速下调,且品种间差异很大。5、构建了 pMAL-c2x-TaFUS3和pMAL-c2x-TaLEC1融合蛋白表达载体,利用宿主菌大肠杆菌BL21菌株对其进行体外表达,表达产物总蛋白经SDS-PAGE电泳检测证实,该两个融合基因能够在原核系统中表达出相应的融合蛋白,其中带有TaFUS3基因的融合蛋白大小约为75KD,带有TaLEC1基因的融合蛋白大小约为70KD。6、构建了 TaFUS3和TaLEC1的过表达和RNAi抑制表达载体,并通过农杆菌介导法进行了小麦遗传转化研究。转基因植株的PCR检测结果表明:获得转TaFUS3正义基因的T1代转基因小麦10株,转TaFUS3 RNAi基因的T1代转基因小麦12株。获得转TaLEC1正义基因的T1代转基因小麦9株,转TaLEC1 RNAi基因的T1代转基因小麦9株。该结果为TaFUS3和TaLEC1在小麦中的功能验证奠定了重要的基础。