【摘 要】
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由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）和禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAd V-4）新基因型引起的鸡肝炎-心包积液综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS）是严重影响我国
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由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）和禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4,FAd V-4）新基因型引起的鸡肝炎-心包积液综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS）是严重影响我国养禽业的两种重要传染病。更为严重的是,IBDV不断变异,尤其是引起法氏囊严重萎缩的变异毒株的出现,导致现有疫苗的免疫效力降低。IBDV和FAd V-4混合感染将造成更加严重的后果。现有的IBD-HHS多联疫苗存在生产成本高、制苗工艺繁琐等缺陷,因此,研制能够同时防控IBDV变异株和FAd V-4感染的新型高效疫苗具有重要意义。本论文评价了基于表达IBDV变异株VP2蛋白的重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2制备二联灭活疫苗的免疫原性和免疫效力,包括以下几个方面的内容:1.疫苗制备用重组病毒r FAd V-4-IBDV/VP的扩增与鉴定为了制备廉价、高效的新型IBD-HHS二联灭活疫苗,团队前期构建了表达IBDV变异株VP2蛋白的禽腺病毒血清4型重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2。本部分研究首先对该重组病毒的体外复制特性进行了再次评价;利用聚合酶链式反应（PCR）、序列测定和Western blot等方法对扩增的用于疫苗制备用重组病毒进行了鉴定。结果显示,重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2在鸡肝癌上皮细胞系（LMH）中的复制良好。IBDV VP2基因插入的位置和方向均正确,VP2蛋白得到高效表达。纯净性试验证明重组病毒符合制备疫苗的要求。2.基于IBDV变异株VP2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立为了客观评价重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2所诱导的抗IBDV变异株的抗体反应和检测IBDV变异株的流行情况,本试验建立了检测IBDV变异株特异性抗体的间接ELISA方法。将IBDV变异株VP2蛋白的编码基因按照大肠杆菌喜好密码子优化合成并克隆到原核表达载体p ET32a中,在大肠杆菌中进行诱导表达。用纯化的VP2蛋白作为包被抗原,经过试验条件优化,建立了检测抗IBDV抗体的间接ELISA方法。试验结果证明,该方法可以检测抗IBDV特异性抗体,与新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、FAd V-4、H5/H7/H9亚型禽流感病毒等禽病病毒的抗血清均无交叉反应,所建立ELISA的批间和批内重复试验的变异系数分别为0.32%～5.66%和1.92%～4.81%,表明重复性良好。所建立ELISA的临床应用评价显示被检地区养殖场均存在不同程度的抗IBDV抗体阳性,平均阳性率为63.67%。所建立的ELISA方法可以用于抗IBDV抗体的检测,为IBD疫苗免疫原性评价和IBDV流行病学调查提供了方法。3.基于重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2的灭活油乳剂疫苗的免疫原性和免疫效力评价为了评价基于重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2的灭活油乳剂疫苗的免疫原性和免疫效力,对2周龄的无特定病原体（SPF）鸡通过肌肉注射途径免疫灭活r FAd V4-IBDV/VP2油乳剂疫苗,利用建立的IBDV间接ELISA抗体检测方法检测疫苗免疫后的抗IBDV抗体水平,利用FAd V-4间接ELISA抗体检测方法检测抗FAd V-4抗体。结果显示,灭活r FAd V4-IBDV/VP2油乳剂疫苗免疫后21 d均可诱导机体产生高水平的抗IBDV和抗FAd V-4特异性抗体。攻毒试验结果显示,灭活r FAd V4-IBDV/VP2油乳剂疫苗对IBDV强毒变异株和高致病性FAd V-4株的攻毒提供完全保护。研究结果显示,重组病毒r FAd V4-IBDV/VP2可以用于制备防控鸡传染性法氏囊病和鸡肝炎-心包积液综合征的廉价、高效二联疫苗。
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