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背景和目的多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄妇女中常见的生殖内分泌疾病,以月经周期紊乱、卵巢多囊、高雄激素血症和胰岛素抵抗等为特征,临床表型具有强烈的异质性。PCOS不仅增加了女性不孕的风险,且患者易发生二型糖尿病、心血管疾病和子宫内膜癌等远期并发症。因此,了解PCOS的病理形成机制,对患者及早诊治具有十分重要的意义。PCOS具有强烈的家族聚集性,提示遗传因素是其病因中的重要因素。高雄激素是PCOS患者的主要病理表型,因此,雄激素代谢及功能相关的雄激素受体基因(AR)和性激素结合球蛋白基因(SHBG)都被列为研究PCOS的候选基因。AR(CAG)n和SHBG(TAAAA)n多态性分别与基因转录活性相关,提示研究其遗传学意义与PCOS的关联性具有十分重要的价值。PCOS可能是一种胎儿起源的疾病,临床研究及动物实验均表明,宫内高雄激素与PCOS的发生密切相关。宫内高雄激素可能通过表观遗传机制影响基因表达,导致雌性胎儿成年后出现PCOS表型。DNA甲基化是最常见的表观遗传学机制,且基因启动子区域CpG位点的甲基化往往抑制转录。本课题选取雄激素合成/功能相关的AR,CYP11A1和CYP17A1基因进行研究,探讨这些基因启动子区域CpG位点的甲基化状态与PCOS之间的关系,了解表观遗传机制在PCOS形成中的重要作用。PCOS往往导致严重的生殖障碍。临床研究表明,PCOS患者卵巢被膜下胶原沉淀增加、皮质及皮质下基质区域明显增厚,提示卵巢局部可能存在纤维化现象,与患者排卵障碍相关。本课题将通过建立PCOS动物模型,检测其卵巢局部纤维化相关因子的表达状况,了解PCOS卵巢纤维化形成的分子机制,为通过抑制纤维化来改善患者排卵状况提供理论依据。方法和结果1.采用PCR方法分别扩增PCOS患者和正常女性基因组中含AR(CAG)n和SHBG(TAAAA)n的DNA片段,进一步通过毛细管电泳技术对PCR产物进行测序。结果表明,PCOS和对照组AR(CAG)n双等位基因均值出现显著差异,PCOS患者较对照组更易携带重复次数较少的CAG等位基因;在患者和对照组中,携带较长SHBG(TAAAA)n等位基因的个体血清中SHBG浓度较低,但SHBG(TAAAA)n等位基因频率和等位基因型频率在PCOS患者和对照组间均无差异。2.在SD大鼠胚胎发育的第16-19天给母鼠皮下注射睾酮,其中雌性个体成年后均表现为肥胖、多囊卵巢、动情周期和内分泌紊乱等类似PCOS特征。通过Q-PCR和焦磷酸测序技术分别检测模型组和对照组AR,CYP11A1和CYP1 7A1基因的表达状况和启动子区域CpG位点的甲基化状态。结果发现,在血液DNA中,PCOS大鼠AR基因中的3个CpG位点和CYP11A1基因中的1个CpG位点的甲基化水平较对照组显著降低。在卵巢组织,PCOS大鼠AR基因中的5个CpG位点和CYP11A1基因中的1个CpG位点的甲基化水平较对照组显著降低。进一步研究发现,PCOS大鼠卵巢组织中AR基因的表达较对照组显著提高,而CYP11A1和CYP17A1的表达却没有改变。3.选取21日龄雌性SD大鼠,模型组每日皮下注射DHEA,对照组注射等剂量的油剂。连续注射35天后,检测血清激素(酶联免疫吸附法),卵巢形态(HE染色)和卵巢中纤维化状态(天狼星红染色和免疫组化染色)。然后,通过实时定量PCR和免疫印迹分别检测纤维化相关因子的mRNA和蛋白表达情况。结果发现,给青春期SD雌性大鼠外源性注射高雄激素可使其成年后表现为类似PCOS患者的特征,且DHEA诱导的PCOS大鼠卵巢组织发生显著的纤维化病变,主要表现为Collagen Ⅳ的表达显著增高。进一步研究发现,其卵巢组织中TGF-β信号通路激活、肌成纤维细胞增多。此外,纤维化相关因子(TGF-β,CTGF和Fibronectin)表达升高,而分解胶原蛋白的胶原酶(MMP2)表达降低。结论1.携带较短AR(CAG)n重复次数的个体易于发生PCOS。2.SHBG(TAAAA)n重复次数与血清SHBG水平呈负相关,但该多态性与PCOS的发生不一定相关。3.雌性个体胚胎期接触高雄激素刺激可使其成年后发生PCOS表型,并导致相关基因表观遗传状态改变,但是关于表观遗传改变和PCOS发生之间的因果关系有待进一步研究。4.PCOS患者卵巢可能纤维化现象,该现象可能与PCOS患者排卵障碍相关。