论文部分内容阅读
目的构建慢病毒介导过表达IL-12基因的BMSCS,观察IL-12基因转染的BMSCs对胃癌移植瘤模型裸鼠的抑瘤作用,探讨半夏泻心汤与IL-12基因转染BMSCs联合对胃癌移植瘤模型裸鼠的抑瘤作用是否有协同增效作用。方法1、无菌条件下取裸鼠股骨,充分冲洗骨髓腔,加入适量含10%胎牛血清的低糖DMEM,离心5～10 min弃上清,加完全培养基培养。当细胞汇合达90%以上时0.25%胰酶-EDTA消化传代。取融合良好的P3代BMSCs,消化、离心,弃上层液体,加入一抗、二抗,孵育,重悬细胞后上FCM检测。2、采用LV5空载慢病毒及IL-12过表达LV5慢病毒转染BMSCs细胞,48h及72小时后,用倒置荧光显微镜观察BMSCs细胞转染的情况,计算慢病毒转染BMSCs的效率。经嘌呤霉素加压筛选,并用荧光定量PCR检测BMSCs细胞中IL-12的表达,建立稳定过表达IL-12基因的BMSCs细胞。3、取SPF级健康BALB/C裸鼠,于裸鼠腋窝皮下接种人胃癌BCG-823细胞,建立人胃癌移植瘤裸鼠模型。4、将人胃癌移植瘤裸鼠随机分为成瘤组(模型组)、LV5空载慢病毒转染BMSCs组(空载组)、LV5-IL-12过表达慢病毒转染BMSCs组(转染组)、半夏泻心汤干预组(药物组)、半夏泻心汤联合LV5-IL-12过表达慢病毒转染BMSCs组(联合组)。模型组给予裸鼠生理盐水灌胃,空载组将空载慢病毒转染的BMSCs给予裸鼠尾静脉注射,转染组将IL-12基因过表达慢病毒转染BMSCs给予裸鼠尾静脉注射,药物组将半夏泻心汤灌胃给药,联合组在尾静脉注IL-12过表达慢病毒转染BMSCs的同时,给予半夏泻心汤灌胃给药,连续干预13d。5、各组经干预后,观察裸鼠一般情况,隔日计算各组胃癌移植瘤裸鼠肿瘤体积、体重及生长情况的变化,计算抑瘤率。6、将各组胃癌移植瘤瘤体组织进行包埋、切片、贴片处理,通过免疫荧光染色,采用激光共聚焦显微镜下观察BMSCs在肿瘤组织的分布,进行细胞计数,计算BMSCs在肿瘤组织的分布。7、将各组胃癌移植瘤瘤体组织进行包埋、切片,制备TUNEL反应混合液,添加细胞核染色液,苏木素染色,封固,光镜下观察肿瘤细胞凋亡情况,并计算凋亡指数(AI)。8、将各组胃癌移植瘤瘤体组织进行包埋、切片,加入一抗、二抗,孵育,中性树胶封片。采用免疫组织化学法检测瘤体组织Bax、Bcl-2蛋白表达,并进行平均光密度值测定分析。结果1、BMSCs培养7天后细胞以达70%-80%融合,细胞为典型的长梭形,并呈集落生长。传代以后,细胞增殖活力强,细胞形态比较均一的长梭形、多角形细胞,其他形态的细胞极少见,达到传代标准。第3代BMSCs的CD44阳性表达为96.68%,而CD34阳性表达极低,仅为1.25%。2、BMSCs细胞转染48h以后,普通光镜下细胞形态规则,生长良好,荧光显微镜下空载慢病毒转染的BMSCs及IL-12基因过表达转染的BMSCs绿色荧光强度增强。72h以后细胞融合现象明显,绿色荧光强度达到最高,转染效率可达90%。3、Q-PCR结果表明,经慢病毒转染后IL-12 m RNA稳定表达于BMSCs中,IL-12m RNA的表达较正常BMSCs、空载慢病毒转染BMSCs组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而正常BMSCs和空载慢病毒转染BMSCs组IL-12 m RNA的表达无显著差异(P>0.05)。4、裸鼠成瘤显示,第3d后裸鼠腋下逐渐出现肿块,并逐渐增大,5~7d肿块无明显变化,第9d后肿块明显增加,第13d各组裸鼠瘤块均显著增加。与模型组及空载组比较,转染组、药物组及联合组瘤块增加较小,有显著统计学意义(P<0.05)。与转染组、药物组比较,联合组瘤块增加最小,有显著统计学意义(P<0.05)。与模型组及空载组比较,转染组、药物组及联合组的抑瘤率分别为36.9%、42.3%、60.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。5、通过免疫荧光染色,激光共聚焦结果显示,空载组、转染组及联合组的肿瘤组织中均可观察到蓝色荧光,分布比较密集。与空载组比较,转染组及联合组肿瘤组织BMSCs的分布明显增多,差异有显著统计学意义(P<0.05);与转染组比较,联合组显著增多,差异有显著统计学意义(P<0.05)。6、TUNEL结果显示,转染组、药物组及联合组胃癌荷瘤裸鼠瘤体组织中出现大量细胞凋亡小体(褐色颗粒),模型组及空载组仅出现少量细胞凋亡小体。与模型组及空载组比较,转染组、药物组及联合组凋亡指数均明显增加,差异有统计学意义(P>0.05)。与转染组及药物组比较,联合组细胞凋亡小体明显增多,凋亡指数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)7、免疫细胞化学结果显示,模型组及空载组有少量Bax阳性细胞,胞浆呈现浅黄褐染色,细胞形态呈圆形。转染组、药物组及联合组Bax阳性细胞明显增多,可见成片的Bax阳性细胞,胞浆呈黄褐色。与模型组及空载组比较,Bax蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。联合组Bax蛋白表达量明显高于转染组及药物组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组及空载组有大量Bcl-2阳性细胞,可见成片的阳性细胞表达,胞浆呈现浅黄褐染色,细胞形态呈圆形。转染组、药物组及联合组Bcl-2阳性细胞明显减少。与模型组及空载组比较,Bcl-2蛋白表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),联合组Bcl-2蛋白表达量明显低于转染组及药物组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1、本实验成功构建了慢病毒介导过表达IL-12基因转染的BMSCs。2、慢病毒空载的BMSCs及过表达IL-12基因的BMSCs均可靶向归巢到胃癌裸鼠移植瘤瘤体组织。3、过表达IL-12基因的BMSCs及半夏泻心汤干预对胃癌裸鼠移植瘤均有一定的抑制作用,二者联合干预有明显的协同增效作用,其抑制作用与降低Bcl-2基因表达,升高Bax基因表达,诱导胃癌细胞凋亡有关。