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CRISPR/Cas9作为第三代人工核酸内切酶,由于其具有操作简单、靶位点广泛、特异性强及效率高的优势,很快成为基因编辑不可或缺的工具,被广泛应用于多种生物。模式生物秀丽隐杆线虫寿命短、结构简单、便于实验观察和操作,常被用来研究不同蛋白质在寿命调控和对不同环境压力的应激反应中的作用机制。秀丽隐杆线虫中AMPK蛋白,14-3-3蛋白和HSP70蛋白等多种蛋白质可能参与抵抗外界压力的过程,鉴于它们在进化过程中的保守性,对它们功能的深入研究将有助于认识其他物种中应激反应的调控机制。秀丽隐杆线虫中aak-1和aak-2分别编码AAK-1与AAK-2蛋白,均为AMPK蛋白α亚基;ftt-2编码FTT-2蛋白,为两个14-3-3蛋白中的一个;f44e5.5/f44e5.4是两个紧邻的基因,编码序列完全相同,编码秀丽隐杆线虫9个HSP70蛋白中的两个。本研究试图通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得这些基因的突变体,以便研究它们在应激反应中的功能。首先,利用实验室前期构建的sgRNA有效性检测系统,来检验对非必需基因aak-1,aak-2,ftt-2,f44e5.5/f44e5.4进行基因编辑的sgRNA的有效性。针对每个基因先选择两个sgRNA,分别位于基因的5’端和3’端,经检测有效后再用于构建突变体。接下来将识别同一基因的两个sgRNA、带有Cas9编码序列的质粒以及标记基因共同显微注射到秀丽隐杆线虫的性腺中。如果导入的外源Cas9对性腺细胞的基因组DNA进行了双sgRNA引导的切割,就有可能通过PCR筛选到带有缺失片段的F1代突变个体,并通过跟踪其后代中缺失片段的稳定传代来确认获得了突变体。为提高对突变体的筛选效率,本研究采取了两种策略:Co-CRISPR的方法以及将Co-CRISPR和sgRNA有效性检测系统结合起来的方法。实验数据表明将Co-CRISPR和sgRNA有效性检测系统结合起来比Co-CRISPR能更有效地富集基因编辑事件。最后,对实验中所获得的突变体:aak-2(xmu2),f44e5.5(xmu3),dpy-13(xmu7),f44e5.5 f44e5.4(xmu4)进行了热抗性的分析,结果显示aak-2(xmu2)突变体热抗性明显下降,与先前的结果一致,而f44e5.5/f445.4的单突变或双突变的热抗性都没有发生明显的变化。本研究结果为秀丽隐杆线虫中CRISPR/Cas9介导的基因编辑提供了有益的借鉴和指导。