用农杆菌浸种法建立白三叶和中华结缕草遗传转化体系的研究

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遗传转化是植物遗传改良和基因功能研究的重要工具。利用转基因技术可以冲破物种界限,实现种间遗传育种,并改良现有的物种性状。应用于植物新品种的培育和改良研究,是筛选培育优良品种极为便捷和有效的途径。白三叶和中华结缕草都是品质优良的草种,具有外观优美、适应性强、抗性强、耐践踏、耐刈割、白三叶根系发达,中华结缕草的根状匍匐茎十分发达,都具有很好的保持水土的作用,在园林绿化中应用较多,同时白三叶营养丰富、产草量高是优良的牧草。本研究以白三叶和中华结缕草的萌动种子为转化受体,利用NPT-Ⅱ筛选基因对影响农杆菌介导的遗传转化外部因素进行了深入探索,通过优化转化条件,建立了农杆菌浸种法的遗传转化体系,通过PCR检测初步验证基因已经整合到植物基因组。主要研究结果如下:1.种子发芽实验结果表明,白三叶种子内部细胞分裂活跃期在催芽后的0-3h。20%NaoH浸泡20min处理对中华结缕草种子打破休眠效果较好,其内部细胞分裂活跃期在催芽后的第5-9d。2.通过研究不同卡那霉素浓度及处理时间对种子萌发及植株生长的影响,建立适宜的卡那霉素筛选体系。本研究确定白三叶种子Kan筛选最适浓度为50mg/L,处理时间为为6-8d。中华结缕草种子Kan筛选最适浓度为75mg/L,处理时间为6-10d。3.遗传转化体系优化实验结果表明,适宜白三叶的遗传转化体系为为种子催芽1h,农杆菌菌液OD600为0.9,真空处理,抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min,20℃恒温振荡培养24h,共培养1d;适宜中华结缕草的遗传转化体系为种子催芽6-7d,农杆菌菌液OD600为0.9,真空处理,抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min,20℃恒温振荡培养48h,共培养2d。4.以未进行遗传转化的植株作为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,扩增NPT-Ⅱ、GUS基因部分片段。对转化后具有卡那霉素抗性的植株进行PCR检测。检测结果表明部分遗传转化植株扩增出的条带和质粒中的目的条带一致,而未转化植株没有扩增出任何条带,说明目的基因已经整合入植物基因组中。
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