研究背景和目的视网膜变性类疾病包括:视网膜色素变性疾病、黄斑变性疾病、Stargardt病、视锥视杆细胞发育不良等疾病。此类疾病的共同特点在于视网膜的关键细胞(包括感光细胞、视网膜色素上皮细胞)的变性、凋亡和坏死,从而导致患者的视功能不可逆的丧失。由于变性和凋亡的感光细胞或视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞不能够进行自我再生,该类疾病目前尚无有效的治疗方法。RPE是单层的色素上皮细胞,位于视网膜神经上皮层与脉络膜之间,其主要功能包括:构成视网膜外屏障、吞噬感光细胞的外节、黑色素能吸收可见光起遮光暗房作用、分泌多种生长因子、细胞因子和神经营养因子以及抗氧化作用等。RPE细胞在发挥其正常生理功能的同时,随之产生了大量的活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)。线粒体是细胞内ROS清除的关键细胞器,也是细胞内最先最易受到氧化损伤的部位。有研究显示RPE细胞线粒体的功能障碍与AMD等视网膜变性类疾病、糖尿病视网膜病变等疾病的发生、发病机制等有着密切的联系。移植健康的视网膜细胞或者健康的视网膜组织,已成为目前最具有前景的治疗策略。干细胞移植治疗视网膜变性类疾病的主要治疗机制包括:细胞替代效应(cell replacement effect)、营养支持效应(by stander effect)、移植区微环境免疫调控(immune-regulatory effect)作用等。干细胞来源的RPE细胞移植是目前治疗湿性AMD等致盲性眼病颇具前景的治疗手段。Rustom等研究人员在体外培养大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)时,发现两个相邻但未直接接触的细胞之间可以通过建立一个直的细长的管道进行连接,将其命名为隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)。并且发现该结构可以作为细胞间物质相互交换、信息相互交流的通道。近来有研究显示间充质干细胞能够通过线粒体交换改善受者细胞的功能。本研究的主要目的是探索干细胞及人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞(human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium,h ESC-RPE)能否与原代分离的遗传性视网膜色素变性模型的皇家外科学院大鼠(Royal college of surgeons rat,RCS rat)的RPE细胞间形成TNT结构、可否进行线粒体转运、线粒体转运方向以及线粒体转运后对RCS大鼠RPE细胞的ROS水平、细胞增殖能力和细胞凋亡水平的影响。初步研究能否通过线粒体转运机制参与干细胞治疗视网膜变性疾病。方法:第一部分:小鼠神经干细胞与RCS大鼠RPE细胞的线粒体转运及其对RPE细胞功能影响的研究1.分别用含有线粒体特异标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记RCS大鼠原代分离的RPE细胞(RCS-RPE)与小鼠神经干细胞(mouse neural stem cells,m NSC)后,将其按照1:1的比例等量直接共培养24 h后,于激光扫描共聚焦显微镜下观察mNSC与RCS-RPE细胞之间TNT的形成及线粒体转运。2.将RCS-RPE细胞与已转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)病毒的mNSC 1:1等量直接共培养48h,然后行流式细胞分选,分选出GFP阴性的RCS-RPE细胞。3.收集分选出的RCS-RPE细胞,与单独培养的RCS-RPE细胞,采用流式细胞术检测细胞ROS水平、细胞周期及细胞凋亡水平。第二部分:正常与损伤的人RPE细胞系(ARPE-19细胞)间线粒体转运及其对损伤ARPE-19细胞功能影响的研究1.分别用含有线粒体特异性标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记正常ARPE-19细胞和用碘酸钠(NaIO3)预先处理24h的ARPE-19细胞,1:1等量直接共培养24 h后,于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成以及线粒体转运现象。2.将200ug/ml Na IO3预处理24h的ARPE-19细胞与转染GFP病毒的ARPE-19细胞等量直接共培养24h,然后进行流式细胞分选,分选出未带GFP的ARPE-19细胞。3.收集分选出的ARPE-19细胞、200ug/ml Na IO3预处理并单独培养24h的ARPE-19细胞、200ug/ml Na IO3预处理并Transwell小室与正常ARPE-19细胞间接共培养的ARPE-19细胞,采用流式细胞术检测细胞ROS水平、细胞周期及细胞凋亡水平。第三部分:hESC-RPE细胞与ARPE-19细胞及RCS-RPE细胞间TNT的形成及线粒体转运方向的初步研究1.分别用含有线粒体特异性标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记hESC-RPE与正常ARPE-19细胞,将其按照1:1比例等量直接共培养24 h后,于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成及线粒体转运情况。2.分别用含有线粒体特异标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记hESC-RPE与200ug/ml Na IO3预处理24h的ARPE-19细胞,按照1:1比例等量直接共培养24 h后,于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成及线粒体转运现象。3.分别用含有线粒体特异标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记hESC-RPE与2000ug/mlNaIO3预处理的ARPE-19细胞,1:1等量直接共培养24 h后,于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成及线粒体转运的现象。4.分别用含有线粒体特异标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记h ESC-RPE与RCS-RPE,1:1等量直接共培养24 h后,于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成及线粒体转运的情况。结果:第一部分:小鼠神经干细胞与RCS-RPE细胞的线粒体转运及其对RPE细胞功能影响的研究1.通过激光扫描共聚焦显微镜观察,mNSC与RCS-RPE细胞之间可见TNT的形成,并且可观察到mNSC将自身线粒体转运到RCS-RPE细胞中。2.体外m NSC与RCS-RPE细胞直接共培养体系下,直接共培养组相比单独培养组RPE细胞的ROS水平有所降低、细胞增殖能力提高、凋亡水平降低,差异均具有统计学意义。说明干细胞能够通过线粒体转运的机制,改善RCS-RPE细胞的增殖、凋亡功能。第二部分:正常与损伤的人RPE细胞系(ARPE-19细胞)间线粒体转运及其对损伤ARPE-19细胞功能影响的研究1.正常ARPE-19细胞与损伤的ARPE-19细胞之间,可以借助激光扫描共聚焦显微镜观察到其间TNT的形成,线粒体从正常ARPE-19细胞向损伤的ARPE-19细胞转运。2.损伤的ARPE-19细胞与正常ARPE-19细胞直接共培养后,ROS水平较单独培养组及Transwell小室间接共培养组均明显降低;增殖能力较单独培养组有所增加,胞凋亡水平较单独培养组有所降低,差异具有统计学意义。表明正常的RPE细胞可以向损伤的RPE细胞转运线粒体,以挽救损伤RPE细胞的功能。第三部分:hESC-RPE细胞与人RPE细胞系(ARPE-19细胞)及RCS大鼠RPE细胞间TNT的形成及线粒体转运方向的初步研究1.通过激光扫描共聚焦显微镜观察到正常ARPE-19细胞与hESC-RPE细胞间可以形成TNT,并且线粒体从正常ARPE-19细胞向h ESC-RPE细胞方向转运。2.借助激光扫描共聚焦显微镜观察到200ug/ml Na IO3预处理的ARPE-19细胞与h ESC-RPE细胞间可以观察到TNT形成,线粒体从200ug/ml Na IO3预处理的ARPE-19细胞向hESC-RPE细胞方向转运。3.借助激光扫描共聚焦显微镜观察到2000ug/ml NaIO3预处理的ARPE-19细胞与h ESC-RPE细胞间可以观察到TNT形成,线粒体从2000ug/mlNaIO3预处理的ARPE-19细胞向hESC-RPE细胞方向转运。4.通过激光扫描共聚焦显微镜可以观察到h ESC-RPE细胞与RCS大鼠RPE细胞间TNT形成,线粒体从RCS大鼠RPE细胞向hESC-RPE细胞方向转运。结论:1.神经干细胞能够通过线粒体转运的机制,改善视网膜变性大鼠RPE细胞的增殖、凋亡功能。2.正常ARPE-19细胞可通过向受损ARPE-19细胞转运线粒体的机制,挽救氧化损伤的RPE细胞的ROS水平、细胞增殖、凋亡功能。3.hESC-RPE细胞可与正常及损伤的ARPE-19细胞间形成TNT结构。h ESC-RPE细胞可与视网膜变性大鼠RPE细胞之间形成TNT结构。线粒体从正常的ARPE-19细胞、损伤的ARPE-19细胞、视网膜变性大鼠RCS-RPE细胞向h ESC-RPE细胞方向转运。我们推测可能是由于线粒体从成熟程度较高的向线粒体成熟程度相对较低的细胞方向转运有关。