原发性肝癌是世界上最高发的恶性肿瘤之一,我国乙型肝炎病毒感染率高,肝癌发病人数占全球的55%。肝移植为肝癌的根治性治疗带来了希望,但是肝移植术后肿瘤的转移复发严重地制约了患者的长期生存,因此,有效防治肝癌肝移植术后的肿瘤转移复发已经成为急需解决的瓶颈问题。目前针对肝移植后肝癌复发的早期预测仍然缺乏敏感特异的标志物,进一步筛选和鉴定新型肝癌预后分子标记物,并建立肝移植后肿瘤复发及预后分子预警体系,对改善肝癌肝移植患者的预后具有重要意义。第一部分基于转录组芯片筛选的新型癌基因MACC1在肝癌复发转移中的作用及分子机制目的：结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1)有助于促进结肠癌等多种肿瘤的转移,但其在肝癌中的作用尚未阐明。本研究将明确新型肝癌基因MACC1在肿瘤中的表达模式,通过体内外研究系统阐明MACC1对肝癌恶性生物学行为的影响及分子机制,探讨MACC1在肝癌肝移植术后肿瘤复发及预后预测中的临床价值。方法：基于人类全基因组表达谱芯片(AgilentG3Human GE8*60K芯片)的转录组研究筛选肝癌发生发展相关基因。采用实时定量PCR、western blot和免疫组化方法检测肝癌细胞系及160例肝癌组织样本中MACC1、Met及FAK的表达水平。构建外源性表达MACC1蛋白的真核重组表达质粒和腺病毒载体,联合RNA干扰技术,观察MACC1过表达或干扰后肝癌细胞活性、抗凋亡能力、成瘤性、迁移和侵袭能力的变化。利用人肿瘤转移基因芯片和western blot方法筛选MACC1表达改变引起的差异基因,探讨分子机制。结果：相对于高中分化肝癌,在低分化肝癌中有179个转录本的表达升高大于两倍以上,138个转录本的表达降低大于两倍以上,新型肝癌基因MACC1在低分化组中的表达水平是高中分化组的2.58倍。MACC1在高转移潜能HCCLM3细胞中的mRNA和蛋白表达水平明显高于MHCC97L, HepG2和SMMC7721细胞,同时其在肿瘤组织中的表达水平也明显高于癌旁组织。在Changliver及HepG2细胞中过表达MACC1蛋白后肝癌细胞的活性、迁移和侵袭能力都得到显著增强；相反,抑制MACC1蛋白的表达能显著降低肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时观察到肿瘤坏死因子-a诱导的细胞凋亡明显增加；动物实验也表明Changliver细胞过表达MACC1后,细胞的成瘤性明显提高并可以有效地促进肿瘤的生长。肿瘤转移基因芯片及蛋白印迹实验显示MACC1过表达可以显著调节Met. FAK和phospho-FAK (Tyr397)等肿瘤转移相关基因的表达。临床分析显示MACC1与Met、 FAK的表达成正相关,而且MACC1与FAK的高表达与肝移植后肿瘤复发和患者的不良预后密切相关,MACC1单独或联合FAK是预测肿瘤复发及预后的独立危险因素。在超越Milan标准或UCSF标准患者中,MACC1高表达者也显示了较高的肿瘤累计复发率及较低的术后总体生存率。结论：MACC1是一个重要的肝癌转移复发基因,介导HGF/Met通路和FAK通路共同参与调控肝癌细胞增殖能力、抗凋亡、成瘤性、迁移和侵袭能力等恶性生物学行为,MACC1单独或联合FAK分析对肝癌肝移植术后肿瘤复发及预后预测具有潜在的临床应用价值。第二部分长链非编码RNA在肝癌肝移植术后肿瘤复发及预后预测中的价值研究目的：系统地筛选鉴定新型肝癌相关长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA),验证其生物学功能并深入探讨相关分子机制,评估新型长链非编码RNA在肝癌发生发展和转移复发中的作用,在此基础之上,建立可以预测肝移植后肝癌复发及预后的“长链非编码RNA分子预测模型”,并对该模型的准确性和有效性进行验证。方法：本研究入选了160例在本中心接受肝移植治疗的肝癌患者,病人的病理参数及随访等临床资料完整。采用实时定量PCR方法在10种肝癌细胞系及76对肝癌和癌旁组织中筛选差异表达的incRNA分子。应用小干扰RNA特异性降低HOTAIR的表达后,观察肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭等恶性生物学行为的变化,并探讨其分子机制。Cox回归分析单个IncRNA分子的表达与肝癌肝移植术后肿瘤复发和患者生存的关系,在此基础上建立“长链非编码RNA分子预测模型”,用于预测肝癌肝移植患者的预后。结果：我们鉴定了7种在肝癌组织中高表达的长链非编码RNA,分别为：HOTAIR、 MALAT1、ncRAN(L)、ncRAN(S)、lncRNA-HEIH、TUC338、ANCR、体外功能研究表明,肝癌细胞中HOTAIR的表达降低可以明显减弱肿瘤细胞的增殖及侵袭能力,同时也增强了肿瘤坏死因子-α诱导的细胞凋亡及对顺铂和多柔比星的化疗敏感性。研究表明HOTAIR高表达,MALAT1高表达,ncRAN(L)高表达,ncRAN(S)高表达,lncRNA-HEIH高表达,TUC338高表达,ANCR高表达是影响肝移植后肿瘤复发及总体生存的危险因素。在此基础之上,我们建立了包含上述7个IncRNA的“长链非编码RNA分子预测模型”,复发风险评分值=(0.727×HOTAIR表达水平)+(0.603×MALAT1表达水平)+(0.666×ncRAN(L)表达水平)+(0.455×ncRAN(S)表达水平)+(0.662×lncRNA-HEIH表达水平)+(0.699×TUC338表达水平)+(0.605×ANCR表达水平)。根据上述建立的模型计算出每个患者的复发风险评分值,运用受试者工作曲线分析方法将肝癌肝移植患者分为肿瘤复发高危组和肿瘤复发低危组(截点值2.5)。较高危患者而言,"IncRNA分子预测模型”判断为低危的肝癌患者肝移植术后具有较好的预后,低危IncRNA评分患者术后1、3、5年肿瘤累计无复发生存率和总体生存率明显高于高危患者。"IncRNA分子预测模型”是预测肝癌肝移植术后肿瘤复发及总体生存的独立危险因素,"IncRNA分子预测模型”判断为高危的肝癌患者较低危患者肝移植术后具有更高的肿瘤复发风险及明显的不良预后。在符合Milan标准、UCSF标准或杭州标准的病人中,低危lncRNA评分患者较高危患者具有更高的累计肿瘤无复发生存率和总体生存率,在符合Milan标准、UCSF标准或杭州标准的病人中,低危lncRNA评分患者的5年累计肿瘤无复发生存率可达到89.8%、88.6%、83.8%,5年总体生存率可达到82.1%、80.7%、79.8%。此外,"lncRNA分子预测模型”的受试者工作曲线下面积大于任何一个单个长链非编码RNA分子,说明lncRNA分子模型的预测能力和准确性优于单个lncRNA分子。结论：首次建立了包含7个长链非编码RNA分子(HOTAIR、MALAT1、ncRAN(L)、 ncRAN(S)、lncRNA-HEIH、TUC338、ANCR)的“长链非编码RNA分子预测模型”,是预测肝移植术后肝癌的复发风险和患者总体生存的独立危险因素。