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胃癌是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一,胃癌的发病率及死亡率均较高。胃癌早期诊断率低,缺乏特异性早期表现,多数患者确诊时已属中晚期,失去手术根治机会,预后极差,通常5年生存率不超过20%。铂类及氟尿嘧啶类是胃癌新辅助化疗、术后辅助化疗及进展期胃癌姑息治疗等最常见的药物。由于存在肿瘤细胞耐药,尤其是肿瘤多药耐药(Multidrug resistance, MDR),严重影响了化疗疗效及预后。如何提高胃癌化疗药物的敏感性,提高化疗疗效是目前临床关注的焦点。肿瘤细胞耐药与肿瘤细胞内DNA损伤修复能力差异及细胞解毒体系巯基分子的过量表达有关。DNA损伤主要通过核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)途径修复,而切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1, ERCC1)在NER中起关键作用。ERCCl低表达可以使肿瘤的发生率增加,ERCCl过表达可对抗铂类的抗瘤效果。ERCC1表达增强所致DNA损伤修复能力的增强是肿瘤细胞对铂类耐药的一大重要原因。细胞内含巯基蛋白以金属硫蛋白(metallothionein, MT)为主,MT是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异蛋白质。MT和肿瘤的发生、发展关系密切,参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化,参与肿瘤耐药,影响肿瘤的治疗和预后。人MT基因包括10个功能性基因和7个非功能性基因。其中金属硫蛋白1H(MT1H)是MT功能性基因之一,目前关于MT1H的资料较少。现在研究较多的是肿瘤组织中ERCC1、MT蛋白和mRNA的表达与化疗耐药及疗效的关系,而外周血中ERCC1、MT1H的研究较少。鉴于此,本课题首先研究人胃腺癌SGC-7901细胞中ERCC1、MT1H的表达在顺铂继发耐药中的作用,然后探讨存在循环肿瘤细胞的晚期胃癌患者铂类化疗前后外周血中ERCC1、MT1H的表达与铂类继发耐药的相关性及有关机制。第一部分顺铂作用前后人胃腺癌SGC-7901细胞株中ERCC1、MT1H的表达及意义目的:研究顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞株的杀伤作用及顺铂作用人胃腺癌SGC- 7901细胞后ERCC1、MT1H表达的变化,探讨ERCC1、MT1H的表达与顺铂继发耐药的关系。方法:MTT法检测顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的增殖抑制率;采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测不同时间、不同浓度顺铂作用后人胃腺癌SGC-7901细胞中ERCC1、MT1H的表达情况。统计学分析采用SPSS 10.0统计软件包进行t检验,半定量结果用x±s表示,P<0.05有统计学意义。结果:1.随着DDP浓度的增加,对人胃腺癌SGC-7901细胞的抑制作用逐渐增强,24小时IC50=14μmol/L,48小时IC50=11μmol/L。2. DDP浓度为2.5μmol/L时,人胃腺癌SGC-7901细胞中ERCC1、MT1H表达开始增高,随着浓度的增加,其表达也增高,DDP浓度为40μmol/L时其表达最高,分别为对照组的2.19和2.82倍,与对照组比较,差别均有统计学意义(P=0.001、P=0.005)。3. 20μmol/LDDP作用12小时后人胃腺癌SGC-7901细胞中ERCC1、MT1H的表达开始增高,随着作用时间的延长,其表达也增高,顺铂作用72小时其表达最高,分别为对照组的2.71和3.15倍,与对照组相比,差别均有统计学意义(P=0.005、P=0.001)。结论:顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的抑制作用呈剂量依赖性。随着DDP浓度的增加及作用时间的延长,人胃腺癌SGC-7901细胞中ERCC1、MT1H的表达增加,推测ERCC1、MT1H可能参与了顺铂的继发耐药。第二部分晚期胃癌患者铂类化疗前后外周血中ERCC1、MT1H的表达及意义目的:研究存在循环肿瘤细胞的晚期胃癌患者铂类化疗前后外周血中ERCC1、MT1H的表达情况,进一步探讨ERCC1、MT1H的表达与胃癌临床病理学特征的关系及与铂类继发耐药的相关性。方法:收集162例经病理学或细胞学确诊的晚期胃癌患者化疗前外周血(15ml),通过8um孔径,47mm直径的滤膜过滤外周血(7.5ml),初步筛选分离肿瘤细胞,用细胞角蛋白8(CK8)抗体、二抗、白细胞共同抗原(CD45)抗体染色并用核酸染料4,6二脒基苯基吲哚(DAPI)染色细胞核后用激光扫描细胞计数仪分析,选出DAPI+CK8+45-细胞,再根据肿瘤细胞细胞核形态、大小最终确认肿瘤细胞。选出存在循环肿瘤细胞的晚期胃癌患者,采用半定量RT-PCR检测其含铂方案化疗前后外周血(7.5ml)中ERCC1、MT1H的表达。患者完成2个周期化疗后按照RECIST标准将患者分为有效组和无效组,比较化疗前后ERCC1、MT1H的表达的变化。统计学分析采用SPSS 10.0统计软件包进行t检验、χ2检验,半定量结果用x±s表示,P<0.05有统计学意义。结果:1.激光扫描细胞计数仪扫描后应用icys3.3软件数据包进行分析:选出DAPI+CK8+ CD45-细胞且细胞核大、深染,呈高核浆比,胞浆内CK8抗体染色呈典型的环形或帽形,则确定为循环肿瘤细胞。162例患者晚期胃癌患者检出循环肿瘤细胞的有108例,检出率为66.67﹪。与健康对照组(检出率为0)相比,有显著统计学意义(P=0.000)。2. 108例晚期胃癌含铂方案化疗后,无完全缓解(CR)病例,部分缓解(PR)40例,稳定(SD)38例,进展(PD)30例,总有效率(CR+PR)为37.04%。3. 108例晚期胃癌患者化疗前外周血中ERCC1的表达与年龄、性别、TNM分期、是否有淋巴结转移无关(P>0.05),而与分化程度相关(P=0.002)。108例晚期胃癌患者中有76例外周血中ERCC1表达阳性,阳性率为70.37﹪。化疗后ERCC1表达水平明显高于化疗前(P=0.000)。有效组与无效组化疗前ERCC1表达水平的差别无统计学意义(P=0.171);有效组与无效组化疗后ERCC1表达水平的差别有统计学意义(P=0.000);有效组化疗前后ERCC1表达水平的差别无统计学意义(P=0.105);无效组化疗前后ERCC1表达水平的差别有统计学意义(P=0.000)。4. 108例晚期胃癌患者化疗前外周血中MT1H的表达与年龄、性别、TNM分期、是否有淋巴结转移无关(P>0.05),而与分化程度有关(P=0.014)。108例晚期胃癌患者中有94例外周血中MT1H表达阳性,阳性率为87.04﹪。化疗后MT1H表达水平明显高于化疗前(P=0.037)。有效组与无效组化疗前、有效组与无效组化疗后MT1H表达水平的差别均无统计学意义(P=0.199、P=0.118),有效组化疗前后、无效组化疗前后MT1H表达水平的差别均无统计学意义(P=0.109、P=0.082)。结论:1.膜滤过联合激光扫描细胞计数仪检测晚期胃癌患者循环肿瘤细胞的方法特异性高,可有效检测晚期胃癌患者循环肿瘤细胞,为肿瘤的早期诊断提供了一种新的简便有效的方法。2.晚期胃癌患者外周血中ERCC1、MT1H的表达与肿瘤的分化程度密切相关,提示ERCC1、MT1H可能参与了胃癌的发生、发展过程。3.晚期胃癌患者外周血中ERCC1表达水平和铂类继发耐药相关。4.晚期胃癌患者外周血中MT1H表达水平和铂类耐药无明显相关。