玉米JMJ20基因的克隆及其功能分析

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玉米是我国重要的粮食作物和饲料作物,也是全世界总产量最高的农作物,具有显著的高产性能,在国民生活中起着重要的作用。表观遗传调控是一个极其复杂的机制,在真核生物中染色质上包含了绝大部分的遗传物质,同时存在着多种表观修饰。组蛋白去甲基化是植物生长发育过程中一种重要的表观遗传调控方式,这种机制可通过改变染色质的状态调控基因的表达,从而在生长发育中起调节作用。高等植物开花过程中的基因调控机理是植物发育的研究热点,开花是植物重要的发育过程,花期的早晚会直接影响作物的生长,也间接影响作物的产量和品质。玉米作为短日照作物,光周期调控途径是决定玉米生长的重要因素之一,因此,解析玉米光周期调控相关基因的功能和分子机制对于改良玉米品种达到高产优质的目标有着重要的指导意义。
  本研究发现并克隆得到玉米中一个组蛋白去甲基化基因JMJ20,通过行使组蛋白去甲基化功能在光周期途径中起重要调控作用。利用蘸花法将JMJ20基因过表达载体导入拟南芥,初步验证该基因通过组蛋白去甲基化参与调控光周期,利用超声波介导法将JMJ20基因敲除载体导入玉米,首次在玉米中对JMJ20基因进行功能解析,分析了组蛋白去甲基化酶JMJ20在光周期调控过程中的作用和分子机制,主要研究结果如下:
  1、利用PCR技术克隆得到玉米JMJ20基因,该基因编码区全长4497bp,编码1498个氨基酸。通过生物信息学软件对该基因进行分析,预测该基因定位在细胞核中,该基因编码的蛋白为不稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构和信号肽,含有JmjC结构域,属于JMJ蛋白家族的一员。
  2、根据JMJ20基因构建其植物过表达载体pCambia3301-JMJ20和CRISPR/Cas9敲除载体,同时设计得到靶点guideRNA序列,用以研究CRISPR/Cas9系统对玉米基因组的编辑情况。
  3、通过蘸花法将JMJ20基因过表达载体转化至野生型拟南芥中,经过Basta除草剂、bar基因试纸条和PCR鉴定,获得阳性过表达拟南芥9株。
  4、通过超声波介导法将JMJ20基因敲除载体转化至玉米自交系B73中,经过Basta除草剂、bar基因试纸条和PCR鉴定,得到T1代2株转基因阳性植株,T2代基因发生编辑的突变体6株。
  5、在转基因拟南芥中,荧光定量PCR结果表明,促开花基因FT表达量明显低于野生型拟南芥,其他调控开花基因无明显变化;表型性状的结果表明,转基因拟南芥与野生型拟南芥相比,其叶片长度、宽度显著减小,叶柄长度极显著减小,叶片数显著增多,开花极显著延迟,一级分枝数无明显变化。
  6、在转基因玉米中,JMJ20基因与CRISPR/Cas9敲除载体的编辑效率的结果表明,突变体玉米基因组发生了部分编辑,植株T2-1-3和T2-2-2中编辑效率较高,其株高、穗位、叶片数、散粉时间、穗长、穗粗、百粒重等性状均显著小于对照,其中T2-1-3的茎粗也显著小于对照,2株的散粉时间也均早于对照,使转基因玉米出现了早散粉的现象;而植株T2-1-1、T2-1-2、T2-2-1和T2-2-3中编辑效率较低,大多数性状均未发生变化,只有T2-1-1的穗粗显著小于对照。
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