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左旋多巴（L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA）是一种高价值芳香族氨基酸衍生物,广泛存在于动物体与植物体内,主要用于治疗帕金森综合征。目前L-DOPA的生产方法化学合成法、植物提取法以及酶催化法,分别存在污染环境、原材料来源受限和底物为二类致癌物等诸多不足。因此,开发一种符合食品药品安全级别的可持续循环型L-DOPA合成体系逐渐受到更多关注。本论文以食品安全级菌株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的产物合成系统为基础,采用基因挖掘技术、合成生物学工具以及模块化代谢工程策略构建了一种基于辅因子四氢生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin,BH4）再生系统的L-DOPA合成体系。本论文主要研究内容如下:（1）采用理性的基因挖掘手段,筛选获得了不同微生物来源的7种酪氨酸羟化酶和6种墨蝶呤还原酶编码基因。基于B.licheniformis表达系统,利用全细胞联合转化法成功获取了多组具有产L-DOPA功能的酪氨酸羟化酶/墨蝶呤还原酶（TH/SPR）合成体系。其中,Sr TH/Pd SPR合成体系的产物量达到66.24 mg/L,两种蛋白分别来源于Streptosporangium roseum DSM 43021和Photobacterium damselae subsp.damselae CIP102761。通过对重组酶Sr TH催化过程的分析,发现L-DOPA产量达到90 mg/L,而副产物7,8-二氢生物蝶呤（7,8-Dihydrobiopterin,BH2）会抑制产物的合成。进一步酶促动力学和热动力学分析,确定BH4存在时,BH2与重组酶Sr TH形成范德华力和氢键并对其产生反竞争性抑制作用,抑制常数Ki为98μmol/L。通过在酶催化体系中添加二氢蝶啶还原酶（Dihydropteridine reductase,DHPR,EC 1.5.1.34）,证明了DHPR蛋白可以缓解该抑制作用并促进L-DOPA的合成。（2）在已筛选的TH/SPR合成体系基础上构建了辅因子BH4再生系统。利用二级质谱等分析手段证明B.licheniformis中表达重组酶Pd SPR可以实现BH4的合成,蝶呤产量为8.1 mg/L。通过表达叶酸生物合成途径GTP环化水解酶I编码基因fol E2,胞外蝶呤产量提升至58.85 mg/L。为进一步增强B.licheniformis的BH4供给能力,首次利用B.licheniformis来源的硝基还原酶Yfk O实现BH4的再生,证明其具有DHPR蛋白的功能。通过酶学性质和酶促动力学分析,发现该酶具有良好的热稳定性并且其底物6,7-二氢生物蝶呤亲和力强于已报道的其他微生物来源蛋白,Km值为139μmol/L。基于重组酶Yfk O在B.licheniformis中成功构建了BH4再生系统,该系统可以替代辅因子的补加,实现L-DOPA的等量合成,产量达到93.14 mg/L。然而,BH4再生系统不能完全解除抑制物BH2的持续积累,促使后续研究利用发酵法对该L-DOPA合成体系进行评价。（3）通过基因的表达和转录水平监测,实现了前体L-酪氨酸的积累,并解析了莽草酸途径调控机制。在B.licheniformis中共表达大肠杆菌来源的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶(Aro Gfbr,D146N)和预苯酸脱氢酶(Tyr Afbr,M53I/A354V)编码基因,解除了关键酶的反馈调控,L-酪氨酸产量达到803 mg/L。通过基因的转录水平监测,挖掘出其它受调控基因aro D和aro K,分别编码莽草酸脱氢酶和莽草酸激酶。基因aro D和aro K表达后,L-酪氨酸产量提升至1200 mg/L。发酵中补加中间体莽草酸发现,L-酪氨酸产量可以进一步提升至1439 mg/L,基因表达不能彻底解除该节点代谢流的限制。通过转录组测序分析与验证,发现新转录文本41s RNA对该节点基因aro D和aro K起到调控作用,而基因yqe I是调控过程中的“中介”。（4）利用模块途径工程系统组装,在地衣芽孢杆菌中构建了基于辅因子BH4再生系统的L-DOPA合成体系。首先,通过定点突变的方法提升了酪氨酸羟化酶模块对BH4的亲和力,叠加突变体Sr THV126L F203Y的L-DOPA合成能力提升20.3%。其次,在BH4供应模块中将血红蛋白编码基因vgb整合至基因组以及敲除竞争途径基因bud C,重组菌45ABvC的蝶呤产量和NADH/NAD+分别提升至112.48 mg/L和1.59。然后,通过敲除调控因子41s RNA,提升L-酪氨酸合成模块的前体供应能力,单位细胞L-酪氨酸产量达到148.0 mg/g DCW。最后,将BH4再生系统整合至基因组,并将上述三个模块共表达,构建了重组菌45ABvCS::PD/HFSRA,L-DOPA摇瓶和补料分批发酵的产量分别达到167.14 mg/L和1290 mg/L。进一步补加前体L-酪氨酸发现,目前胞内L-酪氨酸供应会限制B.licheniformis发酵合成L-DOPA。