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自2014年下半年以来,我国江苏、安徽和山东等养鸭大省的肉鸭养殖地区陆续报道发生一种以肉鸭生长迟缓、上下喙萎缩变短、舌头外露、拉稀、瘫痪等为主要临床症状的传染性疾病,暂时称为“短喙-侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)。该病在樱桃谷鸭和半番鸭均有报道发生,感染群体中10%-50%的鸭子会受影响,发病鸭常因采食困难而严重消瘦,病鸭出栏时体重比健康鸭低20%-30%,给肉鸭养殖业造成极大的经济损失。后经学者分离鉴定,发现该病的主要病原是一种能感染北京鸭的新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus-related virus,NGPV)。本研究建立了不同的NGPV检测方法,调查了临床采集的样本中NGPV的流行情况,初步探究了NGPV的组织嗜性;分离培养多株NGPV毒株,通过进行全基因组扩增测序和对病毒基因组全面的分析,为NGPV基因组特点和致病机制等研究提供新思路;广泛采集不同的临床样本,对NGPV与鸭圆环病毒(DuCV)的混合感染进行了更加全面的调查研究。本研究主要分为以下四部分:1.检测NGPV与GPV的双重半套式PCR方法的建立及应用根据传统GPV和NGPV的衣壳蛋白保守区域序列,应用Oligo7.0软件设计了一对通用引物和两条分别针对传统GPV和NGPV的特异性引物,建立了能一步检测传统GPV和NGPV的双重半套式PCR方法。该方法的最佳反应程序为:95°C 7 min;95°C45 s,51°C 45 s,72°C 55 s,33个循环,最后72°C延伸10 min,4°C保存。该方法特异性好,仅能检测到NGPV与GPV,不与减蛋综合征病毒、鸭乙肝病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等其它常见病原反应;灵敏度高,最低能检测到100拷贝的病原核酸。应用所建立的双重半套式PCR方法对来自15个鸭场的疑患SBDS病的133只病死鸭进行检测,未在收集的病料中检测到传统GPV。共计91.58%(87/95)的5-18日龄的樱桃谷鸭和92.11%(35/38)的17-25日龄的半番鸭检测为NGPV阳性。在NGPV阳性的鸭子中,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、胆汁、胸腺、法氏囊和脑中病毒检出率在樱桃谷鸭中为85.08%至9.20%,在半番鸭中为74.29%-5.71%。根据我们临床检测结果,NGPV在我国华东三省(山东、安徽、江苏)呈流行态势,而患SBDS的病鸭中不存在传统GPV的感染,同时,NGPV对樱桃谷鸭和半番鸭具有广泛的组织嗜性,能够破坏中枢免疫和外周免疫系统以及突破血脑屏障。2.NGPV核酸探针检测方法的建立及应用本试验将新型鹅细小病毒的VP3保守区域的一段长390 bp的序列克隆制备成核酸探针,通过核酸探针的特异性试验结果表明,制备的该核酸探针特异性高,只与GPV和NGPV反应,灵敏性试验结果表明,针对新型鹅细小病毒最低检出量约为6 pg。应用该核酸探针对来自山东、江苏、安徽三省的87只疑患“短喙长舌-侏儒综合征”的樱桃谷肉鸭的870份组织脏器进行检测,结果个体阳性率为89.7%(78/87),在各脏器中心脏和脾脏检出率较高,分别为74.4%和50.0%,在脑中检出率最低为9%,这一检出结果与PCR方法的结果基本一致。以上结果表明,制备的地高辛标记的新型鹅细小病毒核酸探针特异性强,灵敏性高,适合不同来源的鹅细小病毒临床批量诊断和流行病学调查。3.7株NGPV的分离培养及全基因组测序分析为了更好的了解NGPV与传统GPV之间的关系,本研究对2015-2016年分离自不同地区的7株NGPV进行了全基因组测序与分析。比对分析和进化树结果显示NGPV属于GPV的一个分支,与GPV享有92.2%-97.1%核苷酸同源性。与传统GPV的ITR区域相比,NGPV存在5处核苷酸同步变异,6株NGPV(SDLY1512,SDHZ1604,SDDY1605,AH1605,AH1606,JS1603)存在两个14个核苷酸片段的缺失,在Rep蛋白和Cap蛋白分别发现了12处和8处氨基酸同步变异点,这可能与NGPV的基因调控、体液免疫应答以及宿主迁移有重要关联。此外,经过软件分析发现,NGPV分离株SDLY1602被认为是重组毒株,主要亲本为GPV台湾疫苗株82-0321v,次要亲本为GPV野毒株GDaGPV,这是首次发现NGPV野毒株由GPV疫苗株和野毒株重组而来,有助于对NGPV分子生物特性的深入理解。4.NGPV与DuCV混合感染的研究NGPV被认为是樱桃谷鸭SBDS病的主要致病原,然而典型的短喙侏儒症状却无法高成功率的单纯用NGPV病毒在实验室重复出来。由于禽圆环病毒感染会导致类似于SBDS的临床症状,因而鸭圆环病毒被猜测是肉鸭SBDS病的次要病原。本研究中,我们使用两种半套式PCR方法调查了来自20个鸭场共计170只疑患SBDS病的病死鸭以及200枚不同日龄的鸭胚中NGPV和DuCV的混合感染情况。根据我们的调查数据显示,我国山东、江苏、安徽三省的鸭场的NGPV和DuCV混合感染率为100%(20/20),170只病死肉鸭中NGPV与DuCV的混合感染率为63.53%(108/170),其中DuCV-1的检出率为DuCV-2检出率的两倍,说明在肉鸭SBDS中DuCV-1相比于DuCV-2占主要作用。在200枚鸭胚中NGPV与DuCV的混合感染率为3.5%,说明这两种病毒可以通过鸭胚垂直传播。根据对临床SBDS病鸭中NGPV与DuCV感染率的调查统计,我们提出肉鸭的SBDS病是由NGPV与DuCV协同感染导致。