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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，目前其发病率在全世界范围内呈明显上升趋势[1]。我国虽然属于乳腺癌低发国家，但近年来沿海大城市的发病率及死亡率都有所升高。天津地区乳腺癌发病率从1981年的16.91／100，000增加到2000年42.25／100，000，粗发病率增加了150％，目前位居女性恶性肿瘤发病的第二位，而且年龄别发病率显示发病高峰有年轻化的趋势[2]。 乳腺癌的发病原因，流行病学人群宏观研究认为，一部分与生理、生育和遗传因素有关，另一部分则与环境因素有关。近年来随着分子生物学技术的进展与更新，乳腺癌发生的分子机理研究也逐层深入，发现了一些乳腺癌易感基因和相关基因。然而由于生命活动真正的执行者是蛋白质，基因水平无法涵盖并解释一切表型[3]，因此乳腺癌的分子生物学研究领域进入蛋白质组学阶段。 鉴于国际上蛋白质组学研究自提出开始亦不过十年，乳腺癌相关蛋白质数据库尚不完善，因此乳腺癌蛋白质组学研究于国内外尚很少有报道。由于细胞培养过程的相对标准化，结果具有良好的可对比性，而且实验条件易于操控，因此建立于细胞系模型基础上的技术方法研究，是进行乳腺癌相关蛋白质组学研究的基础。基于此目的，本项研究正是以体外培养的乳腺癌细胞为对象，与正常乳腺上皮细胞表达的蛋白质进行对比，从中寻找差异蛋白，为阐明乳腺癌发生发展中蛋白组的变化奠定基础。此外本研究也以乳腺癌患者和健康对照者血清为研究对象，其目的依然是希望能够直接从血清中获得诊断标志物，最终提高乳腺癌的早期发现与早期诊断能力。天津医科大学博士学位论文第一部分:蛋白质分离一双向电泳实验技术的建立与优化目的:1.建立细胞和血清表达蛋白质组研究中双向凝胶电泳 (孙。一dimensi。nal gel eleetrophoresis，ZoE)技术分离蛋白质的实验 方法与优化条件。2.寻找ZDE图谱上乳腺癌细胞系与正常乳腺上皮细胞系之间以及原 发性乳腺癌患者与健康对照者血清之间的差异表达蛋白点。方法:1.对乳腺浸润性导管癌细胞系T47D以及正常乳腺上皮细胞系 HBL一1 00进行体外培养，收集细胞，经裂解液破碎细胞后提取总蛋 白。将细胞蛋白样品和血清样品分别进行双向凝胶电泳实验，第一 向采取固相pH梯度等电聚焦电泳，第二向采用SDs一聚丙烯酞胺凝 胶垂直电泳，最后进行硝酸银和考马斯亮蓝染色。2.通过ImageMaster双向电泳图像分析软件对ZDE图谱进行数字化分 析匹配与对比，并通过统计学分析方法评价双向凝胶电泳结果。3.在重复性实验过程中进行各个实验步骤的优化和改良。结果:1.采用优化的双向凝胶电泳技术获得了重复性良好的图谱结果。ZDE 图谱中分子量在20一67kDa以及pH在4~8区域之间的蛋白点分离 效果较好。2.乳腺癌细胞T47D的ZDE图谱分辨率为804个蛋白点;正常乳腺上 皮细胞HBL一1 00中可分辨769点。T47D与HBL一100细胞中蛋白点 的匹配率为89.5%，存在197个差异表达蛋白点。3.乳腺癌患者与健康对照者血清ZDE图谱中平均可识别287个蛋白 点，匹配率达到96.8%，血清中存在23个差异蛋白点。天津医科大学博士学位论文结论:1，采用优化后的双向凝胶电泳技术条件能够成功地进行乳腺癌蛋白 质组学研究中蛋白质的分离。2.乳腺癌细胞系T47D与正常乳腺上皮细胞系HBL一1 00之间ZDE蛋 白表达谱相似，二者之间存在蛋白质表达差异。3.原发乳腺浸润性导管癌患者与健康对照者血清的ZDE蛋白表达谱 十分相似，不过二者之间的确存在差异表达蛋白点。第二部分:蛋白质鉴定—质讲分析与生物信息学研究目的:1.鉴定在乳腺浸润性导管癌细胞系T47D和正常乳腺上皮细胞系 HBL一1 00以及在乳腺浸润性导管癌患者和健康对照者血清ZDE图 谱中存在的差异蛋白质。2.对鉴定出的各个蛋白质进行功能查询，进行与乳腺癌相关分析，推 测它们在乳腺癌发生发展中的作用机理。方法:1.在制备型ZDE图谱中分别选取T47D显著高表达的5个蛋白点， HBL一1 00中显著高表达的3个蛋白点，以及原发乳腺浸润性导管癌 患者与健康对照者的配对血清图谱中存在差异的3个蛋白点，经过 胶内胰蛋白酶解，进行高效液相色谱一电喷雾一离子阱质谱分析。2.质谱获得的肤图和氨基酸序列经过SEQUEsT数据库检索分析后， 识别鉴定各个蛋白质。3.通过搜索PDB和SWIss-PROT蛋白质数据库，对鉴定出的各个蛋 白质进行功能查询与乳腺癌相关分析。天津医科大学博士学位论文结果:1.成功地获得了各个蛋白点的肤谱图和肤段氨基酸序列，经过数据库 检索分析后，鉴定了n个蛋白质。2.在T47D和HBL一100的8个差异表达蛋白质中，其中6个为曾经有 过乳腺癌相关文献报道的蛋白:热休克蛋白27、细胞角蛋白K6、 过氧化物氧还蛋白2，泛素梭基端酷酶Ll和前列腺素DZ合成酶 21和旁胸腺素;其余2个为国际上尚未报道与乳腺癌有关的蛋白 质:胞质无机焦磷酸酶和FUSE一结合蛋白。3.乳腺癌血清蛋白质组学研究中鉴定出的3个差异蛋白质分别为:Ig 人链C区、结合珠蛋白，血清白蛋白与豆