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T-DNA插入突变是构建水稻突变体库和研究水稻基因功能的重要方法之一。近年来,我们实验室构建了一定规模的水稻T-DNA插入突变群体,并进行了相关T-DNA整合机理研究以及突变体表型和突变基因功能的研究。对于有明显表型突变,且突变表型和T-DNA插入紧密连锁的突变体,我们首先利用T-DNA标签的方法克隆该突变基因,进而通过正向(突变体的遗传和分子分析)和反向遗传学(过量表达和RNAi干扰分析)等手段,研究突变表型和突变基因的内在关系以及该突变基因在水稻中所起的可能功能。而对于大部分没有明显可见表型变化的突变体,我们通过大规模克隆其T-DNA旁邻水稻序列,根据旁邻序列和水稻基因组序列的比较分析确定各个突变体中的T-DNA插入位置。如果某个突变体中T-DNA插入位置(附近)存在我们所感兴趣的基因,那么可以根据该基因可能行使的功能,设计相应的实验来分析该突变体内在的生理生化表型变化(如代谢产物变化,对激素或重金属敏感性的变化等),以及通过正向和反向遗传学手段来对其突变基因的功能进行系统研究。本文正文的两个部分是分别以有明显表型变化的突变体和无明显可见表型变化的突变体为材料进行研究的两个范例。W378是从水稻T-DNA插入群体中获得的一个晚开花和矮化表型的突变体。遗传分析表明其突变表型和T-DNA插入紧密连锁。以T-DNA为标签,克隆了W378中的突变基因OsLFL1(Oryza sativa LEC2 and FUSCA3 Like 1),根据获得的全长cDNA推测的蛋白序列比较分析显示,该基因编码一个含B3 DNA结合域的转录因子,其蛋白氨基酸序列与拟南芥种子发育控制蛋白LEC2和FUSCA3同源性较高。表达分析表明,OsLFL1基因只在野生型中花11的穗和幼胚中特异表达,而在突变体W378中该基因在茎、叶等各个组织中都有表达(异位表达)。在W378中水稻光周期途径中关键的开花基因Ehd1的表达被检测到有明显下调,并且Ehd1下游的开花基因Hd3a、RFT1和OsMADSs的表达也都被显著抑制。在野生型水稻中过量表达OsLFL1的转基因实验和利用RNAi下调突变体W378中OsLFL1基因表达的表型回复实验,证实了突变体W378的晚开花表型是由于OsLFL1基因过量表达所造成的。利用凝胶滞后(EMSA)和染色体免疫共沉淀(ChIP)实验表明,在体外和体内条件下OsLFL1蛋白都能和Ehd1基因启动子区域含有保守的RY重复序列的DNA片断相结合,这暗示着OsLFL1可能是Ehd1的调控因子。上述工作阐明了水稻突变体W378产生迟开花表型的分子机理,即由于T-DNA的插入造成了OsLFL1基因的异位表达,使原来穗和幼胚特异表达的OsLFL1基因在叶片中也有了表达;在叶中大量积累的OsLFL1蛋白与Ehd1基因(只在叶中表达)启动子区域RY重复序列直接作用,从而抑制Ehd1基因的表达并进而使Ehd1下游的多个开花相关基因表达下调,最终造成突变体开花的延迟。此外我们还对OsLFL1基因其它可能的生物学功能进行了初步的讨论。L395是T-DNA插入群体中一个没有明显可见表型变化的突变体。该突变体中T-DNA旁邻序列和拟南芥谷氨酰半胱氨酸合成酶基因DNA序列同源性较高,所以认为T-DNA可能是插入到水稻谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(OsGCS)内部。鉴于水稻中还未有该基因的报道,我们通过T-DNA标签的方法克隆了该水稻谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(OsGCS)。序列比较显示该突变基因位于水稻第5染色体上(OsGCS5),而在水稻第7染色体上还有OsGCS的另外一个拷贝(OsGCS7)。在L395突变体中,T-DNA是单拷贝形式插入在OsGCS5基因的第二内含子和外显子连接处,并且造成了三个碱基的缺失,但是突变体在重金属耐受性、OsGCS基因表达以及体内GSH含量方面和对照中花11相比没有明显的差别。所以认为OsGCS5的突变可能为另外一个拷贝的OsGCS7基因功能互补。OsGCS5和OsGCS7基因的编码区域DNA序列和推测的蛋白氨基酸序列一致性非常高,但是它们的启动区域DNA序列完全不同。以GUS为报道基因的OsGCS5和OsGCS7启动子表达分析表明在水稻大部分组织中两个OsGCS基因都有表达,但OsGCS5基因的表达强度远低于OsGCS7基因。茎和茎节处的徒手切片结果显示,OsGCS5基因主要在维管束附近薄壁细胞(基本组织细胞)中表达,而OsGCS7基因的表达主要在集中在维管束中。OsGCS5和OsGCS7基因的器官表达模式的差异暗示了两个基因可能具有不同的功能。