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生长素极性运输是生长素调控植物生长发育和环境响应的独特方式,主要决定于质膜定位的生长素极性输出载体PIN(PIN-FORMED)。PIN的输出活性和极性定位决定生长素的极性流向和浓度梯度。之前的研究暗示,拟南芥PIN极性定位受网格蛋白介导的质膜内吞调控,但具体调控机制仍不清楚。已有研究表明,动物细胞质膜蛋白内吞受其自身内吞分拣基序(endocytic sorting motif:如“YxxΦ”和“LL”基序)调控,但植物细胞质膜蛋白是否也具有相似的调控机制目前仍缺乏确切证据。为揭示内吞分拣基序在PIN2极性定位和根尖向地性生长中的生物学功能,基于本实验室前期工作,本研究运用生物信息学、遗传学、细胞生物学、生理生化等研究手段或方法,初步阐明拟南芥PIN2内吞分拣基序在根尖向地性生长中的调控机理。具体研究结果如下:(1)生物信息学分析结果表明,拟南芥质膜定位的PIN蛋白(PIN1、2、3、4和7)含有14个“YxxΦ”和5个“LL”候选内吞分拣基序。通过分子克隆和定点突变技术,以PIN2-GFP为模板,成功构建了 19个PIN2内吞分拣基序突变表达载体(用mPIN2-GFP表示)。(2)利用农杆菌介导的花侵染法,将这19个mPIN2-GFP表达载体导入pin2突变体中,获得T3代纯合株系。遗传学分析结果表明,16个mPIN2-GFP载体(mPIN2-GFP-4至-19)能有效互补pin2根尖向地性缺陷表型,表明这16个突变位点不是PIN2介导根尖向地性的关键位点。相反,有3个突变位点(mPIN2-GFP-1、-2和-3)未能有效互补pin2突变体表型,表明这3个突变位点是PIN2介导根尖向地性的关键调控位点。(3)根尖重力刺激响应分析结果表明,mPIN2-GFP-1和-2根尖生长对重力刺激不敏感,表现出与pin2突变体相似的表型;而mPIN2-GFP-3根尖生长对重力刺激仍有部分响应,进一步证实这3个内吞分拣基序在PIN2介导的根尖向地性生长中具有重要调控功能。(4)细胞生物学分析结果表明,mPIN2-GFP-1和-2的极性定位没有下降反而上升,而mPIN2-GFP-3的极性定位下降,暗示前者可能与PIN2极性输出活性调控相关,而后者可能与PIN2极性定位调控相关。根尖生长素分布分析发现,与pin2突变体相似,mPIN2-GFP-2和-3根尖生长素过量积累。根尖重力刺激实验结果表明,与PIN2-GFP相反,2-h重力刺激未能诱导根尖上下两侧mPIN2-GFP的不对称分布。根据以上遗传学和细胞生物学的分析结果,本研究可得出以下初步结论:内吞分拣基序通过调控PIN2极性定位或输出活性,从而调控PIN2介导的根尖向地性生长。本研究结果为进一步剖析PIN极性定位的分子调控机制和PIN介导的生长素极性运输机制提供新的观点与见解。