卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）是最常见的女性生殖系统原发恶性肿瘤之一,其死亡率居妇科肿瘤之首。其起病隐匿,约70%病人发现时即为晚期、70%患者术后1-2年内出现复发、五年生存率不到40%,因此EOC又被称为“沉默杀手”。目前,卵巢癌的标准治疗方案主要是外科手术分期后联合以铂类、紫杉醇为基础的化疗,但随着用药时间延长,约70%的患者在进展期时会对化疗药物产生抗药性,化疗耐药已成为目前导致EOC患者总体预后差的主要原因。因此开发更加有效的药物或其它治疗手段对于改善卵巢癌的治疗现状具有重要临床意义。细胞自噬是肿瘤中一种高度保守的促细胞存活机制。自噬发生时,受损细胞器、错配蛋白质等胞浆内容物被双层膜结构包裹形成自噬小体,并与溶酶体结合形成自噬溶酶体从而将内容物降解为小分子蛋白、多肽和氨基酸供细胞重复利用。肿瘤细胞不仅可利用自噬适应各种应激如缺氧、饥饿、缺血等促进细胞存活及增殖,尤其自噬还广泛参与放疗、化疗及靶向治疗过程从而有助于肿瘤细胞适应上述治疗压力并产生抵抗。大量研究表明应用自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤（3-MA）、氯喹（CQ）、羟氯喹（HCQ）等）或敲除自噬关键基因（抑制ATG5、ATG7等）抑制自噬后可增强许多抗肿瘤药物对卵巢癌的治疗效应,提示抗肿瘤药物引起的自噬与卵巢癌预后密切相关。因此为卵巢癌寻找新型抗肿瘤药物时,探究待开发的药物是否上调肿瘤自噬水平、研究介导自噬的分子机制是需要重点关注的问题。天然植物中草药用于预防和治疗疾病尤其是肿瘤治疗方面具有悠久的历史。利用中药有效成分研发肿瘤治疗新药一直备受科研工作者青睐,因其效果理想、多靶点发挥作用、生物安全性高且易推向临床。近期研究表明多种具有抗癌活性的中药有效成分可激活细胞自噬,对肿瘤细胞起着双重性作用:大部分研究提示诱导的自噬发挥细胞保护性作用拮抗凋亡性细胞死亡,少量研究发现诱导自噬可导致细胞死亡,因此对中药是否诱导自噬以及对其抗肿瘤作用所产生的影响进行深入研究从而展开调控对于开发新型抗肿瘤药物并提高其治疗效果具有重要的意义。丹皮酚是由毛莨科芍药属植物干燥根或全草中提取出的活性成分,临床上可被用于治疗心血管疾病、糖尿病、关节炎等,表现出良好的安全性。近年来研究发现丹皮酚更是一种具有潜力的新型抗肿瘤药物,可有效抑制多种恶性肿瘤生长。我们前期研究发现丹皮酚对卵巢癌细胞株A2780也有一定的抗肿瘤作用,然而丹皮酚是否能够诱导自噬并且在卵巢癌细胞中对其抗肿瘤作用产生何种影响及具体机制尚缺乏系统研究及验证。本研究主要对上述问题及相应的分子机制展开了进一步研究。本研究发现丹皮酚作用于卵巢癌A2780、SKOV3细胞株后,在体外可抑制细胞增殖并诱导一定的凋亡,而且对正常卵巢上皮细胞IOSE80无明显细胞毒性。我们进一步发现丹皮酚能够诱导卵巢癌细胞自噬发生并激活完整自噬流,且具有时间及浓度梯度依赖性。联合使用自噬抑制剂抑制自噬可增强丹皮酚诱导的卵巢癌细胞增殖抑制及促进凋亡作用,提示我们丹皮酚在卵巢癌细胞中诱导的自噬发挥细胞保护性作用。分子机制上,我们发现丹皮酚可经由下调Akt/m TOR信号通路激活卵巢癌细胞中的自噬。联合自噬抑制剂在体内动物模型中可有效干扰丹皮酚所诱导的保护性自噬并明显增强丹皮酚的抗肿瘤作用,并且对于动物模型来说相对安全。第一部分丹皮酚对卵巢癌细胞生长的影响及机制目的:验证丹皮酚对卵巢癌细胞生长的影响及机制,同时探究丹皮酚对正常卵巢上皮细胞的影响。方法:分别用不同浓度丹皮酚处理人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3 24h和48h,同时以正常卵巢上皮细胞IOSE80作为对照探究丹皮酚对正常细胞的细胞毒性。采用CCK-8法检测不同浓度丹皮酚对卵巢癌细胞活力的影响;采用平板克隆形成实验检测不同浓度丹皮酚对卵巢癌细胞克隆形成率的影响。Annexin-V PE/7-AAD双染细胞后经流式细胞仪检测不同浓度梯度的丹皮酚对卵巢癌细胞株凋亡率的影响,以顺铂处理组做为阳性对照,并同时探究丹皮酚对正常卵巢上皮细胞IOSE80凋亡率的影响。Western Blot法检测不同浓度梯度的丹皮酚对卵巢癌细胞株中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达比值的影响。结果:1.丹皮酚可抑制卵巢癌细胞的细胞活力与增殖CCK-8检测结果示:丹皮酚低浓度组（0.3m M）细胞活力抑制作用不明显,但在中高浓度组（0.6m M以上）均可抑制细胞存活率,具有浓度和时间梯度依赖性,并且对人正常卵巢上皮细胞IOSE80的细胞毒性明显降低。平板克隆试验结果显示中高浓度丹皮酚能够抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力,呈一定的剂量梯度依赖性,提示中高浓度的丹皮酚均具有抗肿瘤的长期作用。2.丹皮酚可诱导卵巢癌细胞凋亡流式细胞仪检测结果示丹皮酚可诱导一定的凋亡率,以高浓度的丹皮酚凋亡诱导作用较为显著,呈一定的浓度梯度依赖性。同时未见丹皮酚对正常卵巢上皮细胞IOSE80凋亡率产生增强作用。Western Blot结果显示:与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比,丹皮酚处理组Bcl-2蛋白表达水平显著降低;而Bax蛋白的表达在丹皮酚处理后明显增加,均呈浓度依赖性。上述数据都表明,丹皮酚在卵巢癌细胞中可有效诱导内源性细胞凋亡。第二部分丹皮酚经由Akt/m TOR信号通路诱导卵巢癌细胞保护性自噬目的:探究丹皮酚在卵巢癌细胞对自噬的影响及所发挥的作用,并探讨具体分子机制。方法:1.分别采用不同浓度梯度和不同时间梯度丹皮酚工作液处理卵巢癌A2780及SKOV3细胞,Western Blot检测自噬关键蛋白LC3和p62表达变化。透射电子显微镜（TEM）下观察细胞超微结构变化情况,重点观测自噬小体数量的变化。采用m RFP-GFP-LC3自噬双荧光腺病毒预转染A2780细胞后,以1.2 m M丹皮酚工作液按不同时间梯度处理卵巢癌细胞,共聚焦荧光显微镜下观察m RFP及GFP LC3荧光信号变化探究有无完整自噬流。2.采用m RFP-GFP-LC3自噬双荧光腺病毒预转染A2780细胞后联用自噬抑制剂3-MA或HCQ与丹皮酚联合处理,共聚焦荧光显微镜下观察m RFP及GFP LC3荧光信号变化情况探究对卵巢癌细胞自噬流的影响。采用自噬抑制剂3-MA或HCQ联合丹皮酚分别处理卵巢癌A2780和SKOV3细胞,Western Blot法检测各组自噬关键蛋白LC3和p62表达变化情况。应用CCK-8法探究采用自噬抑制剂3-MA或HCQ联合丹皮酚处理对卵巢癌细胞增殖的影响;并采用Annexin V-PE/7-AAD试剂盒经流式细胞仪探究采用自噬抑制剂3-MA或HCQ联合丹皮酚处理对卵巢癌细胞凋亡的影响,以明确丹皮酚介导的自噬发挥细胞保护性作用或是导致自噬性细胞死亡。3.采用Western Blot法检测不同浓度丹皮酚处理卵巢癌细胞后调控自噬经典通路--Akt/m TOR信号通路关键基因Akt、m TOR与p70S6K蛋白及磷酸化蛋白p-AKT、p-m TOR与p-p70S6K表达变化。分别以Akt抑制剂MK2206或以m TOR抑制剂Rapamycin联用丹皮酚处理卵巢癌细胞增强对Akt/m TOR信号通路的抑制行回复实验,Western Blot法检测细胞内Akt/m TOR信号通路与自噬相关蛋白的表达变化情况,从而对Akt/m TOR信号通路在丹皮酚诱导卵巢癌细胞自噬中所起的作用进行验证。结果:1.丹皮酚诱导卵巢癌细胞发生自噬并激活完整自噬流Western Blot结果显示不同浓度和不同时间丹皮酚处理组A2780及SKOV3细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高,p62则下调,呈浓度梯度依赖性和时间梯度依赖性;因1.2m M诱导自噬效果最强,所以将1.2m M作为探究联合作用的后续实验的浓度。电镜结果显示丹皮酚处理组中A2780及SKOV3细胞中均出现多个自噬小体或自噬溶酶体。丹皮酚作用于预先转染了m RFP-GFP-LC3自噬双荧光腺病毒的卵巢癌细胞后于共聚焦荧光显微镜下观察,结果示丹皮酚可诱导卵巢癌细胞中自噬发生并激活完整自噬流,并且该现象在48h进一步增强,与Western Blot结果相一致。2.自噬抑制剂可阻断丹皮酚在卵巢癌细胞中介导的自噬流Western Blot示3-MA联合丹皮酚处理组卵巢癌细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达量下调,p62的表达量增加;而HCQ联合丹皮酚处理组中LC3-II及p62蛋白表达量均增加,上述结果表明自噬早期抑制剂3-MA或自噬晚期抑制剂HCQ可显著抑制卵巢癌细胞中丹皮酚所诱导的自噬。转染m RFP-GFP-LC3自噬双荧光腺病毒后共聚焦荧光显微镜下检测联用丹皮酚与自噬抑制剂后卵巢癌细胞中自噬流的变化,结果表明3-MA可于自噬早期阻断丹皮酚诱导的自噬,而HCQ可在自噬晚期阻断丹皮酚诱导的自噬,结果与Western Blot结果一致。3.抑制自噬增强丹皮酚对卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞的生长抑制CCK-8法检测结果显示与单用丹皮酚组相比,丹皮酚联合3-MA或HCQ处理组的细胞活力均有明显下降;流式细胞仪检测结果表明,与单用丹皮酚组相比,丹皮酚联合3-MA或HCQ处理组的细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均增加,以晚期凋亡率增加最为显著,上述结果提示丹皮酚在卵巢癌细胞中所诱导的自噬呈细胞保护性作用。4.丹皮酚在卵巢癌细胞中经由Akt/m TOR信号通路抑制从而诱导自噬Western Blot结果显示与对照组相比,A2780与SKOV3细胞丹皮酚处理组的Akt、m TOR表达水平无明显变化,而p-Akt、p-m TOR与p-p70S6K蛋白表达量明显下降,且呈一定的剂量梯度依赖性。上述结果提示,Akt/m TOR信号通路下调参与了丹皮酚在卵巢癌细胞中的抗肿瘤作用,因此推测该信号通路可能参与了丹皮酚在卵巢癌细胞中诱导的自噬。进一步Western Blot结果表明,与单用丹皮酚组相比,在丹皮酚联用MK2206处理组中见LC3-Ⅱ表达升高,p-Akt及p-m TOR表达降低。提示选用Akt抑制剂MK2206联用丹皮酚处理卵巢癌细胞下调Akt蛋白表达后可更有效激活自噬。Western Blot结果表明,与单用丹皮酚组相比,在丹皮酚联用Rapamycin处理组中见p-m TOR明显下调,而LC3-Ⅱ表达明显增加。提示选用m TOR抑制剂Rapamycin联用丹皮酚处理卵巢癌细胞下调m TOR蛋白表达亦可更进一步激活自噬。由此可见,Akt/m TOR通路下调在丹皮酚诱导的卵巢癌细胞自噬中可能发挥着重要作用。第三部分丹皮酚联合自噬抑制剂增强卵巢癌移植瘤模型中的抗肿瘤作用目的:探究丹皮酚、联用丹皮酚与自噬抑制剂对卵巢癌动物模型移植瘤生长的影响。方法:构建卵巢癌细胞移植瘤裸鼠模型,按每组7只随机分为3组:DMSO对照组、丹皮酚单用组、丹皮酚+HCQ联用组。定期监测肿瘤体积并绘制生长曲线;观测丹皮酚、丹皮酚联用HCQ在体内的抗肿瘤作用以及对动物的毒性;收取移植瘤组织行HE染色;IHC法检测丹皮酚联用HCQ对卵巢癌裸鼠移植瘤凋亡的影响、自噬信号通路的影响;观察各组祼鼠模型中单用丹皮酚、丹皮酚联用HCQ处理时心脏、肝脏、肺脏、肾脏变化情况。结果:丹皮酚可抑制体内卵巢癌移植瘤的生长,联合自噬抑制剂HCQ在体内动物模型中可明显增加丹皮酚的抗肿瘤作用。丹皮酚联合自噬抑制剂处理卵巢癌体内动物模型结果显示:1)丹皮酚单用组、丹皮酚+HCQ联用组均可降低皮下肿瘤的大小和抑制移植瘤的重量,提示均有抑制A2780移植瘤体内生长的效果,而且丹皮酚联用HCQ抑制移植瘤体内生长效果更显著;2)单用丹皮酚以及丹皮酚联用HCQ在动物体内对小鼠的毒性较低。3)移植瘤H＆E染色结果提示相对于丹皮酚单用组及DMSO组,联用丹皮酚与HCQ可更有效促进移植瘤的坏死。4)IHC结果提示在动物模型体内联用HCQ可增强丹皮酚抑制肿瘤细胞增殖以及促凋亡能力;丹皮酚在体内可以诱导卵巢癌A2780细胞株发生自噬,并且联用HCQ也可以在体内有效阻断晚期自噬从而抑制自噬。与体外细胞实验结果相一致。5)H＆E组织切片光镜下观察各组祼鼠模型中单用丹皮酚、丹皮酚联用HCQ处理时,重要脏器心脏、肝脏、肺脏、肾脏各脏器基本结构均正常,未见转移灶形成及炎症改变,提示单用丹皮酚、丹皮酚联合HCQ在体内动物模型中对重要脏器均未显现出明显毒性。结论（1）丹皮酚可通过抑制细胞增殖并诱导一定的细胞凋亡对卵巢癌细胞发挥生长抑制作用。（2）丹皮酚诱导卵巢癌细胞自噬发生并激活完整自噬流,丹皮酚诱导的卵巢癌细胞自噬发挥细胞保护性作用。（3）Akt/m TOR通路下调在丹皮酚诱导的卵巢癌细胞自噬中可能发挥着重要作用。（4）联合自噬抑制剂在体内动物模型中可有效抑制丹皮酚所诱导的保护性自噬并明显增强丹皮酚的抗肿瘤作用。