论文部分内容阅读
该研究根据GENBANK中查出的禽流感病毒H<,5>亚型,禽流感病毒H<,9>亚型的HA片段基因组序列,利用DNASIS软件分别对AIV的H<,5>、H<,9>亚型HA基因区域进行同源性比较,设计筛选出两对联合PCR反应的特异性引物,其中一对是H<,9>亚型通用引物,扩增出HA片段695bP,另一对引物为H<,5>亚型的通用引物,扩增出的HA区域部分目的片段约为448bP.建立各自的单项RT-PCR,并用电泳鉴定PCR扩增产物,结果证明为各自的特异性核酸片段.在单项RT-PCR基础上,优化引物浓度,Mgcl<,2>浓度,Tag酶、dNTP浓度,循环次数等反应条件后,建立了H<,5>、H<,9>亚型的多重RT-PCR,同时扩增出禽流感病毒H<,5>、H<,9>两种亚型不同大小的特异性片段,并进行了反应条件的优化.建立的多重RT-PCR扩增其它相关病毒未见阳性结果.两个亚型的单项RT-PCR可以检测鸡胚尿囊液培养物10<-3>稀释物,多重PCR可以检测到10<-2>稀释物.初步应用四份于鸡胚尿囊液培养物,六份临床病料的检测,并与电镜负染、琼扩及病毒分离的结果进行比较,此诊断方法与病毒分离的结果一致,比琼扩和电镜负染检出率高,可用于临床和试验室诊断.