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第一部分BPA体外对人卵巢颗粒细胞HOXA7相关表观遗传的影响目的研究BPA体外处理对人卵巢颗粒细胞HOXA7、EZH2的表达以及HOXA7的启动子区甲基化程度的影响。方法收集预行IVF-ET的妇女的卵泡液,提取人卵巢颗粒细胞进行培养。用CCK8试验检测BPA对人卵巢颗粒细胞的毒性作用。用荧光定量PCR法及Western blot法分析不同剂量的BPA处理对人卵巢颗粒细胞HOXA7、EZH2的表达的影响。用甲基化特异性PCR法分析不同剂量的BPA对人卵巢颗粒细胞HOXA7基因启动子区甲基化程度影响。结果1.CCK8试验提示BPA浓度在100-500uM之间时,随着BPA浓度的升高,细胞存活率逐渐从80%以上下降至10%以下。2.荧光定量PCR及Western blot的结果显示,0.01-100uM之间等比梯度浓度的BPA处理过后的人卵巢颗粒细胞中HOXA7的表达均降低(P<0.05),EZH2的表达均升高(P<0.05),且有剂量依赖性。3.甲基化特异性PCR法结果:BPA浓度为100,10,1,0.1uM组可观测到甲基化阳性。结论0.01-100uM之间等比梯度浓度的BPA处理过后的人卵巢颗粒细胞中HOXA7的表达降低,EZH2的表达升高,HOXA7的启动子区发生高甲基化。BPA可能通过升高EZH2这一甲基化相关酶类的表达,使HOXA7基因启动子区发生高甲基化,最终导致HOXA7基因的表达相对沉默。第二部分GSK126逆转BPA体外对人卵巢颗粒细胞HOXA7相关表观遗传的影响目的研究GSK126处理、BPA与GSK126共同处理对人卵巢颗粒细胞HOXA7、EZH2的表达以及HOXA7的启动子区甲基化程度的影响,验证BPA可能通过升高EZH2,使HOXA7基因启动子区发生高甲基化,最终导致HOXA7基因的表达相对沉默这一假设。方法收集预行IVF-ET的妇女的卵泡液,提取人卵巢颗粒细胞进行培养。用CCK8试验检测GSK126对人卵巢颗粒细胞的毒性阈值。用荧光定量PCR法及Western blot法分析GSK126处理、BPA与GSK126共同处理对人卵巢颗粒细胞HOXA7、EZH2的表达的影响。用甲基化特异性PCR法分析GSK126处理、BPA与GSK126共同处理对人卵巢颗粒细胞HOXA7基因启动子区甲基化程度影响。结果1.CCK8试验提示GSK126浓度为5uM时对人卵巢颗粒细胞的细胞生存率影响最小。2.荧光定量PCR及Western blot的结果显示,加入浓度为5uM的GSK126处理过后相比于100uM的BPA单独处理,人卵巢颗粒细胞中HOXA7的表达上调,EZH2的表达下调。3.甲基化特异性PCR法结果:BPA与GSK126共同处理组以及GSK126处理组均为甲基化阴性。结论本实验进一步证实BPA通过升高EZH2,使HOXA7基因启动子区发生高甲基化,最终导致HOXA7基因的表达相对沉默。GSK126可以逆转这种机制。