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低温是限制植物分布与生长的重要因素之一。目前,CBF/DREB(C-repeat binding factors/dehydrate responsive element binding factor)途径已被证实是赋予植物低温抗性的主要途径之一。CBF受到ICE(inducer of CBF expression)的诱导表达后,会与COR(cold regulated)基因启动子区域的CRT(C-repeat elements)结合,激活500多个COR基因,编码多种功能蛋白,最终赋予植物低温抗性。然而,CBF途径是一个高耗能的过程,它会导致植物生长延滞及赤霉素合成下降,因此,植物只有在特殊条件下才启动它的表达。为了尽量减少CBF途径的激活对植物产生的不利影响,它的精确调节显得十分重要。拟南芥的RD29A只在干旱、低温和高盐时表达,其启动子便成了理想的逆境诱导性启动子。因此,我们实验室选择诱导型启动子RD29A来诱导CBF1的表达,以期获得生长良好的抗冻花卉。实验的主要内容和结果如下:1.利用NCBI上提供的CBF1序列设计引物,引物两端含有XbaI和SacI酶切位点,扩增长度为728bp;利用NCBI上提供的RD29A序列设计了两对引物,下游引物相同位于5516bp,上游引物1位于4521bp处,引物2位于4987bp处,含有Xba Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点,RD29A长启动子(long promoter,RD29A-LP)和短启动子(short promoter,RD29A-SP)的扩增长度分别为:995bp和529bp。经测序验证,CBF1和RD29A-LP、RD29A-SP同NCBI上序列的同源性分别为CBF1,99.87%;RD29A-LP,98.70%;RD29A-SP,99.87%。2.利用二元载体pBI121,使用其上的XbaI、SacI和Hind Ⅲ的三个酶切位点,选择相应的酶两两进行酶切。最终构建了 pBI121-RD29A-LP-CBF1、pBI121-RD29A-SP-CBF1、pBI121-35S-CBF1三个表达载体,并成功转化到农杆菌GV3101和LBA4404内。通过实验比较,最终选择农杆菌LBA4404作为转化介质将表达载体转化到相应的花卉中。3.选择雏菊叶片为外植体,成功的构建了雏菊的再生体系。其中,雏菊叶片的最佳再生培养基为:MS+6-BA1.0mg/L +NAA 0.3mg/L,再生率为:79.20%,最佳生根培养基为:MS+6-BA1.Omg/L,再生率为:88.90%。4.确定了遗传转化时Kan筛选压力和Cef抑制LBA4404生长的最低浓度。其中雏菊叶片不定芽分化的最佳Kan筛选压力:50mg/L;不定芽生根的最佳Kan筛选压力为:5mg/L。而Cef抑制农杆菌LBA4404生长的最低浓度为:200mg/L,如此可将Cef对植物再生的影响减少到最小。5.经过叶片不定芽分化时的Kan筛选和不定芽生根时的Kan筛选,初步获得了 30株pBI121-RD29A-SP-CBF1转基因雏菊幼苗和20株pBI121-RD29A-LP-CBF1转基因雏菊幼苗。用CTAB法提取每株DNA进行PCR验证,得到了两株雏菊pBI121-RD29A-LP-CBF1转化植株。观察这两株转基因苗与未转化雏菊的表型发现,转基因系开花延迟,叶片较少;同时这两株转基因系之间也有区别,转基因系L3比L5叶片多且绿,长势较好。初步冷处理实验中,将转基因系L3与对照在0℃的条件下冷处理两天,结果对照存活而转基因系死亡,目前尚未得到理想的抗冻转基因系,后续工作还在进行中。