论文部分内容阅读
乳腺癌是我国女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。髓样癌是乳腺癌中的一种特殊组织学类型，其独特的病理特征和较好的预后之间仍有许多不明之处，需要更进一步的研究。肿瘤的治疗一直是困扰临床的难点，因此，筛选抗肿瘤的药物成为研究热点。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是一群具有较强自我更新能力、能够多向分化的细胞，且与肿瘤的发生、转移、复发相关。研究表明利用标记物能够分选出某种肿瘤中的CSCs。乳腺髓样癌的干细胞标记物尚无报道，因此，寻找和鉴定分选乳腺髓样癌干细胞的肿瘤标记物，是进一步研究乳腺髓样癌生物学特性等的基础。近年来还研究发现：肿瘤的复发与肿瘤干细胞具有明显相关，因此，寻找能够杀伤CSCs的药物对临床治疗显得尤为重要。针对上述问题，本研究以乳腺髓样癌细胞系Bcap37为细胞模型，PROCR(endothelial protein C receptor)和ESA (epithelial specific antigen)为分选标记物，检测Bcap37细胞中PROCR~+/ESA~+细胞比例，并通过NON/SCID小鼠体内成瘤实验；克隆形成实验、细胞周期实验以及干性相关基因检测等体外实验，以证明PROCR~+/ESA~+分选的细胞是否具有干细胞特征。为了验证槐耳清膏是否对干细胞具有抑制作用，将槐耳清膏分别加入到PROCR~+/ESA~+的细胞中，并观察给药前后细胞克隆形成能力的变化；同时，为进一步验证槐耳清膏是否对肿瘤干细胞有杀伤或者抑制作用，本研究选用了乳腺癌另一细胞模型--SUM159细胞系进行进一步的验证，通过槐耳清膏给药前后对乳腺癌SUM159细胞成球能力、克隆形成能力的影响，并且运用流式细胞术检测给药前后，SUM159中ALDH1hing比例的变化。初步研究槐耳清膏是否对乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells, BCSCs)具有能杀伤或者抑制效果，为临床治疗提供新的线索。研究方法和主要结果1.乳腺髓样癌Bcap-37细胞系肿瘤干细胞的分选鉴定方法：以CD24/CD44、PROCR/ESA为分选标记物，运用流式细胞术分选乳腺髓样癌Bacp-37细胞,通过体外克隆形成实验、细胞周期实验、干性相关基因检测等实验，体内NOD/SCID动物成瘤模型来证明：CD24/CD44不是该细胞系最好的干细胞标记物，而以PROCR~+/ESA~+分选的细胞具有干细胞特征。结果1.流式细胞术检测Bcap37细胞系中， CD44~+/CD24-/low的比例为52.7%,PROCR~+/ESA~+的比例为3.2%；克隆形成实验结果表明：CD44~+/CD24-/low分选细胞克隆形成的数目和Non CD44~+/CD24-/low分选的细胞克隆形成数目无差异(P＞0.05)；PROCR~+/ESA~+细胞克隆形成的数目大于PROCR-/ESA-细胞(P<0.05)，提示PROCR~+/ESA~+细胞具有较强的克隆形成能力。细胞周期实验表明：PROCR~+/ESA~+的细胞能够在48小时以内从G1期进入G2和S期，而PROCR-/ESA-的细胞几乎不进入分裂周期；干性相关基因检测实验表明：PROCR~+/ESA~+的细胞高表达NANOG、OCT4和BMI1(P<0.05)；NOD/SCID动物成瘤模型实验表明：PROCR~+/ESA~+的细胞在成瘤的数目、成瘤的体积均要大于PROCR-/ESA-细胞(P<0.05)。2.槐耳清膏对乳腺癌干细胞作用的初步研究方法：观察槐耳清膏给药前后对PROCR~+/ESA~+的Bcap-37细胞克隆形成的影响；应用CCK-8法检测槐耳清膏对SUM-159细胞的IC50值，并观察给药前后SUM-159细胞形态学变化、对克隆形成能力和成球能力的影响，以及用流式细胞术检测给药前后SUM-159细胞的ALDH1high细胞比例变化。结果：槐耳清膏能抑制PROCR~+/ESA~+的Bcap-37细胞的克隆形成(P<0.05)；CCK-8检测结果显示：槐耳清膏对Sum-159细胞系的IC50值约为10mg/mL。以浓度为0mg/mL、1mg/mL、10mg/mL的槐耳清膏作用于Sum-159细胞，发现随着浓度的增加，克隆形成的菌落数目逐渐减少(p<0.05)。成球数目和大小也逐渐降低(p <0.05)。以10mg/mL的浓度作用该细胞后，用流式细胞术检测ALDH1比例发现，ALDH1high细胞的比例由给药前的2.8％降到1.5％，而以1μg/mL浓度的紫杉醇作用该细胞后，ALDH1high细胞的比例由给药前的2.8％升到9.1％。结论1、FCM分选乳腺髓样癌细胞系Bcap37中PROCR~+/ESA~+亚群细胞具有较强的成瘤能力和多向分化能力，具有CSCs的特性。PROCR~+/ESA~+可作为乳腺髓样癌细胞系Bcap-37的CSCs细胞亚群分选标记物。2、槐耳清膏对人乳腺癌细胞系Bcap37细胞的克隆形成、Sum159细胞的克隆形成和成球能力具有明显的抑制作用。同时能够降低Sum-159细胞中ALDH1high细胞的比例，提示槐耳清膏可能对乳腺癌Sum-159细胞中的干细胞具有一定的杀伤作用。