论文部分内容阅读
背景和目的:胶质瘤是一种具有侵袭性的预后较差的中枢神经系统肿瘤,其治疗与预后生物标志物仍未阐明,S100A10参与多种肿瘤恶性生物学特征,但在胶质瘤中的生物学功能及其与胶质瘤病理级别和治疗预后的关系仍不清楚。本研究探究S100A10表达在胶质瘤进展中的作用,探索S100A10与胶质瘤病人预后是否相关,进一步探讨了S100A10受miR-21-5p调控影响胶质瘤的恶性特征,为胶质瘤生物学特性研究提供新思路,并为胶质瘤患者预后提供预测指标。方法:1.从公共数据库（包括TCGA,CGGA,GEPIA2）下载S100A10的表达和临床信息数据,获取胶质瘤患者基因表达数据、临床意义及随访信息,以鉴别S100A10的差异表达及其预后价值。2.收集79例诊断为不同级别原发性胶质瘤的患者的癌与癌旁组织和6例脑损伤患者的正常脑组织,制作成组织芯片,用于病理HE染色和S100A10免疫组织化学染色,分析癌与癌旁以及不同级别胶质瘤S100A10的表达水平差异。3.采用实时荧光定量PCR法（qPCR）检测胶质瘤细胞系与正常胶质瘤细胞S100A10 mRNA表达水平差异,以及使用Western blotting检测不同级别胶质瘤与正常脑组织S100A10蛋白表达差异。4.使用siRNA敲低S100A10的表达,采用CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell、流式细胞术检测S100A10下调组与NC组U87和U251胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的变化,采用Western blotting检测下调S100A10的表达后胶质瘤干细胞干性标记物和U87和U251胶质瘤细胞上皮间充质转化标记物的变化。5.通过miRNA靶基因在线预测网站预测S100A10的上游MicroRNA（miR-21-5p）,通过双荧光素酶实验验证miR-21-5p在下游靶基因S100A10的3’UTR的结合位点,以确认S100A10是否是miR-21-5p的直接靶标,Western blotting实验检测抑制和过表达miR-21-5p后对下游靶基因S100A10表达的影响。6.在下调miR-21-5p的U87和U251细胞株中共转染S100A10的干扰RNA（si-S100A10）,检测抑制S100A10的表达能否减弱miR-21-5p inhibitor对U87和U251细胞的生物学功能影响,并使用流式细胞术、Transwell实验,Western blotting实验进行分析。结果:1.数据库分析提示在胶质瘤组织中S100A10的表达水平较癌旁高,并且高表达预示更差预后,并与患者生存期呈负相关。2.实时荧光定量PCR和Western Blotting显示S100A10 mRNA和蛋白在胶质瘤组织较癌旁组织表达水平明显升高（P<0.05）;与正常胶质细胞相比较,Western blotting结果也显示S100A10在胶质瘤细胞系中表达水平显著升高（P<0.05）。3.CCK-8实验显示干扰S100A10的表达能够显著抑制U87和U251细胞的增殖（P<0.05）;细胞划痕实验显示干扰S100A10的表达能够显著抑制胶质瘤细胞的迁移能力（P<0.05）;Transwell实验显示干扰S100A10的表达能够显著抑制胶质瘤细胞侵袭能力（P<0.05）;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,敲低S100A10的表达能够增加胶质瘤细胞U87和U251的凋亡率（P<0.05）。4.Western Blotting显示干扰S100A10的表达能够降低胶质瘤干细胞表面标记物Nestin和CD133的表达（P<0.05）;并且上皮间充质转化标记物Vimentin表达下降,E-cadherin表达上升（P<0.05）。5.双荧光素酶实验证实S100A10是miR-21-5p的下游靶基因,S100A10的表达受miR-21-5p的影响,抑制miR-21-5p的表达能够上调S100A10表达,而过表达miR-21-5p能够下调S100A10表达（P<0.05）。6.CCK-8实验、流式细胞术检测细胞凋亡实验表明抑制miR-21-5p的表达能够促进U87和U251细胞增殖、减少细胞凋亡率（P<0.05）;而过表达miR-21-5p抑制U87和U251细胞增殖、增加细胞凋亡率（P<0.05）。7.Transwell侵袭实验和细胞凋亡实验表明,降低S100A10的表达显著逆转了miR-21-5p inhibitor对U87和U251侵袭的促进作用,并且逆转了miR-21-5p inhibitor对U87和U251细胞对细胞凋亡的抑制作用（P<0.05）。结论:胶质瘤组织和细胞中S100A10表达水平与胶质瘤细胞恶性特征相关,下调S100A10的表达能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间充质转化,增加胶质瘤细胞的凋亡率以及降低胶质瘤干细胞的干性标记物的表达,S100A10是胶质瘤患者预后的一个新预测指标;S100A10的表达受miR-21-5p的影响,S100A10是miR-21-5p的下游靶基因。