条斑紫菜PyCaM基因与PyHSP70基因的克隆、原核表达及功能分析

来源 :辽宁师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jzymw
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条斑紫菜(P.yezoensis)是我国重要的经济类海藻之一,隶属于红藻纲,红毛菜科。主要分布在日本、韩国和中国。  本研究首先以条斑紫菜CaM基因和HSP70基因为关键词,在GeneBank的dbEST数据库中搜索相关的EST片段,使用DNAMAN软件对搜索得到的EST片段进行拼接,分别得到两条contig。利用NCBI网站的BlastX功能进行序列分析,分析结果指向其他物种CaM基因和HSP70基因。通过序列比对,contig引物设计,PCR产物回收,获得这两条基因,并通过测序进行验证,命名为PyCaM,PyHSP70。生物信息学分析显示,PyCaM ORF序列共453bp,编码150个氨基酸,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,编码蛋白质的分子量约为16700Da,等电点为4.12,信号肽预测结果显示PyCaM无信号肽序列。对PyCaM核苷酸序列进行BLASTx分析,结果显示,与其他藻类CaM核苷酸序列相似性较高,达到90%以上,并预测到EF手型区域以及钙离子结合位点;PyHSP70ORF序列共2007bp,编码668个氨基酸,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码蛋白质的分子量约为72000Da,等电点为5.17,信号肽预测结果显示PyHSP70无信号肽序列。将PyCaM、PyHSP70 ORF序列分别与pET-28a载体重组,构建两个重组表达载体,并转入大肠杆菌BL21感受态细胞,获得转基因菌株,经IPTG诱导融合蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳检测证实PyCaM分子量约为16700Da,PyHSP70分子量约为71000Da,与预测值相符合。将大量诱导的蛋白进行纯化和质谱检测,证明此二蛋白即为条斑紫菜PyCaM、PyHSP70融合蛋白。  从实时荧光定量PCR的结果可以看出,条斑紫菜PyHSP70、PyCaM基因响应高温诱导并显著高于对照组,分别在热胁迫1小时、3小时时转录水平达到最高。通过测定条斑紫菜PyHSP70融合蛋白的ATPase活性,证明PyHSP70具有ATPase活性。在测定大肠杆菌转条斑紫菜PyHSP70基因在高温胁迫下生长情况的实验中,转基因大肠杆菌的生长情况明显好于对照组,证明条斑紫菜PyHSP70融合蛋白的过量表达可以提高大肠杆菌的耐热性。本研究第一次利用凝胶覆盖技术证明条斑紫菜融合蛋白PyCaM与PyHSP70在体外具有结合效应,这些结论对进一步研究植物热激信号转导通路奠定理论基础。
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