研究背景脊髓脊膜膨出等神经管缺陷是导致小儿神经原性膀胱功能障碍的最主要的病因,可致截瘫、大小便失禁、脑积水、性功能障碍、骨骼畸形和精神损害等严重后果。胎儿外科手术可能是早期干预脊髓脊膜膨出的较好方法,但对于手术效果等还有待利用动物模型等进一步的研究。以往的脊髓脊膜膨出动物模型多为手术造模或基因突变系动物,与人类的脊髓脊膜膨出有较大的差异,维甲酸诱导SD孕鼠,产生脊髓脊膜膨出胎鼠,可能是一个较理想的动物模型。另外,脊髓脊膜膨出后脊髓损伤,导致膀胱神经和肌肉的改变,其相关神经损害及相互关系目前还尚未完全明确,需要进一步的研究。第一部分维甲酸诱导脊髓脊膜膨出胎鼠动物模型的优化目的：在本实验室建立和优化维甲酸灌喂孕SD大鼠诱导产生脊髓脊膜膨出胎鼠的动物模型,探讨最佳的灌喂时间点和剂量,以得到较高的胎鼠脊髓脊膜膨出率和较低的死胎率,同时希望脊髓脊膜膨出胎鼠膨出范围较小。方法：按孕鼠灌喂时间分为3组：孕9天组(孕9天9a.m.左右灌喂维甲酸),孕9.5天组(孕9天晚11p.m.左右灌喂维甲酸),孕10天组(孕10天9a.m.左右灌喂维甲酸)。实验组：SD孕鼠灌喂全反式维甲酸,溶于2m1橄榄油中；对照组：SD孕鼠仅灌喂2m1橄榄油。灌喂剂量：孕9天组剂量从60-110mg/kg不等,分为若干小组；孕10天组剂量从40-120mg/kg不等,分为若干小组；孕9.5天组剂量分为80和100mg/kg两个小组。在胚胎16,18,20天(E16,E18,E20)分别剖腹产取出胎鼠,统计总孕鼠数、总胎鼠数、MMC胎鼠数、死胎/吸收胎数等数据。对实验组,计算MMC率(MMC胎鼠占所有胎鼠的比率)、死胎率(死胎/吸收胎占所有胎鼠的比率)和活胎MMC率(MMC胎鼠占所有活胎的比率),数据用Stata7软件进行Pearsonχ2检验,以P<0.05为有显著性差异。结果：1.孕9天日间灌喂组按维甲酸灌喂剂量分为60、70、80和110mg/kg4个小组,共18只孕鼠,209只胎鼠。各剂量组所得到的MMC胎鼠率都非常低(0-1.92%),死胎率却非常高(90.91%-100%)。2.孕10天灌喂组按维甲酸灌喂剂量分为40、50、60、70、80、85、90、100和120mg/kg9个小组,共59只孕鼠,604只胎鼠。剂量为120mg/kg时,胎鼠MMC率最高,为29.95%,活胎MMC率也最高,为38.99%,而死胎率相对较低(23.19%)。3.孕9.5天灌喂组按维甲酸灌喂剂量分为80和100mg/kg2个小组,共41只孕鼠,423只胎鼠。两组MMC率分别为31.66%和29.41%,没有统计学差异；活胎MMC率分别为44.21%和55.56%,也没有统计学差异；而死胎率80mg/kg组为28.40%,显著低于100mg/kg组的47.06%(P=0.001)。此外,在80mg/kg组,有一些MMC膨出的范围较小的胎鼠。第二部分不同胎龄脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神经损害的形态学观察目的：通过不同胚胎期MMC胎鼠膀胱平滑肌的发育和神经支配情况及脊髓神经损害的形态学观察,以期了解这种损害的时间和空间上的变化及其相互关系。方法：胎鼠分为MMC组(灌喂维甲酸后产生MMC的胎鼠)和正常对照组(灌喂橄榄油后产生的正常胎鼠),每组再根据胎龄各分3小组,即胚胎16天组(E16),胚胎18天组(E18),胚胎20天组(E20),共6小组。取各组腰骶段脊髓切片,用免疫组织化学法检测脊髓的GFAP、VAChT的表达；取各组膀胱切片,检测a-Actin和neurotubulin-β-Ⅲ的表达；另取各组腰骶段脊髓及膀胱切片,作HE染色。Leica QWin软件拍摄显微镜下照片,Image-Pro Plus5.1软件分析免疫组化照片相关部分的光密度,SPSS16.0软件对数据进行进行统计分析,以P<0.05为有显著性差异。结果：1.在胚胎16天,2组胎鼠的膀胱肌层内就已经可以检测出neurotubulin-β-Ⅲ的表达；胚胎16、18和20天时,MMC组胎鼠膀胱内的neurotubulin-β-Ⅲ表达较相同胚胎期的正常对照组显著降低。2.在胚胎16、18、20天,2组的膀胱肌层内都能看到较多的α-Actin的阳性显色；且各胚胎期,2组膀胱内的α-Actin表达无显著性差异。3.在胚胎16天和18天,正常组和MMC组及胚胎20天正常组的脊髓内,GFAP染色均很少,没有明显的星形胶质细胞显示,在胚胎20天的MMC组胎鼠的脊髓背侧,可见大量的GFAP阳性的星形胶质细胞显影,其表达显著高于正常组。4.MMC组各个胚胎期脊髓VAChT的表达都较少,在胚胎20天组的背外侧核仅见少量阳性表达的神经元；而正常组VAChT的表达相对较多,在胚胎20天组的背外侧核可见较多阳性表达的神经元；2组间各胚胎期VAChT表达差异均有统计学意义。结论1.本实验室,孕10天120mg/kg灌喂组、孕9.5天80mg/kg和孕9.5天100mg/kg灌喂组均能取得30%左右的MMC率；比较死胎率而言,前两者显著低于后者,是较为理想的制模条件。2.孕10天120mg/kg灌喂组制模所得胎鼠MMC巨大,畸形表现复杂、多样,伴发其他严重畸形,可能对神经原性膀胱的研究带来干扰因素；孕9.5天80mg/kg灌喂组制模所得胎鼠伴发其他严重畸形相对较少,与临床病例表现更为接近,部分胎鼠MMC很小,可能更适合用于胎儿外科等研究。3.MMC胎鼠膀胱平滑肌的分化和发育与正常组相比无显著差别。4.MMC胎鼠胚胎16天,膀胱肌层内可见神经支配,但神经纤维减少,这与脊髓内骶副交感神经核和背外侧核的胆碱能神经元减少是同步的,这两个区域分别是支配膀胱逼尿肌的盆神经和支配尿道外括约肌阴部神经的节前神经元分布的区域。5.MMC胎鼠脊髓损伤后的神经修复过程,星形胶质细胞的出现要晚于胚胎18天；在胚胎20天,脊髓的背侧(即MMC突起于羊膜腔的一侧)出现大量的星形胶质细胞。