论文部分内容阅读
白屈菜(Chelidonium majusL.)中富含生物碱类成分白屈菜碱,其抗肿瘤作用显著。研究表明,白屈菜碱对膀胱癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、直肠癌、结肠直肠癌等,均有显著的抗肿瘤作用,近年来受到国内外研究学者的广泛关注。本论文前期研究发现,白屈菜碱不仅对人胃癌SGC-7901细胞、人乳腺癌MCF-7细胞具有明显的抗肿瘤作用,而且对耐阿霉素的人乳腺癌细胞MCF-7/DOX同样具有显著的增殖抑制作用,其诱导肿瘤细胞死亡的机制可能是引起肿瘤细胞发生有丝分裂灾难。本论文以MCF-7细胞、MCF-7/DOX细胞为对象,进一步研究白屈菜碱诱导这两种细胞发生有丝分裂灾难死亡的作用及可能机制,并确定经历有丝分裂灾难后,细胞的最终死亡途径。论文研究结果将为以白屈菜碱为主要成分的新型抗乳腺癌药物的开发提供依据。有丝分裂灾难为有丝分裂过程失调而发生的细胞死亡现象,是一个真正意义的内源性肿瘤抑制机制,本论文的研究结果还将为耐药肿瘤的治疗提供新的思路。本论文首先采用Giemsa染色法观察白屈菜碱(12 μmol/L)作用人乳腺癌MCF-7细胞及其耐药细胞MCF-7/DOX 24 h、48 h、72 h后对细胞形态学的影响,并计算有丝分裂指数(mitoticindex,MI)。进一步采用Western Blot法考察了白屈菜碱对两种细胞内Chk1、p-Chk1、Plk-1、Aurora-A、Cdc25C、Securin、P21 表达的影响,探讨白屈菜碱诱导MCF-7和MCF-7/DOX细胞发生有丝分裂灾难的分子机制。研究结果显示,随着白屈菜碱作用时间的延长,上述两种细胞边缘形状模糊,细胞体积变大、变扁平,细胞间间隔逐渐增大,大核、多核细胞出现且明显增多;与阴性对照组比较,MI显著升高(P<0.05或P<0.01);总体上看,白屈菜碱在作用细胞48 h后,随作用时间的延长,可显著下调 MCF-7、MCF-7/DOX 细胞的 Chk1、Plk-1、Aurora-A、Cdc25C 的表达水平(P<0.01),白屈菜碱作用24 h后,显著上调p-Chk1、Securin、P21的表达水平(P<0.01或P<0.05)。为了研究白屈菜碱诱导MCF-7、MCF-7/DOX细胞发生有丝分裂灾难后最终的死亡途径,采用DAPI染色法观察白屈菜碱(12 μmol/L)作用上述两种细胞不同时间对细胞形态的影响;并采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测白屈菜碱作用后,两种细胞的凋亡率变化。同时,采用AnnexinV-FITC/PI双染免疫荧光显微镜观察细胞形态,并采用Western Blot法考察白屈菜碱(12 μmol/L)对两种细胞内凋亡相关蛋白P53、Caspase-3、Caspase-9和Survivin表达的影响。结果显示,随着白屈菜碱给药时间延长,可见两种细胞的多核、微核现象明显增加,并且伴有核浓缩,染色加深,部分细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体,并被细胞膜所包绕;两种细胞的总凋亡率随时间的延长显著增高(P<0.05或P<0.01);荧光显微镜下,呈红绿相间的荧光的凋亡细胞数量也逐渐增多,说明白屈菜碱诱导乳腺癌及其耐药细胞发生有丝分裂灾难后,部分细胞最终凋亡。Western Blot研究结果表明,随着白屈菜碱作用时间的延长,两种细胞内Survivin蛋白表达量显著降低,而Caspase-9、Caspase-3、P53蛋白表达量均显著升高(P<0.01)。综上所述,白屈菜碱能够诱导MCF-7、MCF-7/DOX细胞发生有丝分裂灾难,其机制与其可调节肿瘤细胞内 Chk1、p-Chk1、Plk-1、Aurora-A、Cdc25C、Securin、P21 蛋白的表达水平有关。白屈菜碱诱导MCF-7、MCF-7/DOX细胞发生有丝分裂灾难后,部分细胞最终发生细胞凋亡,其机制可能是白屈菜碱通过上调P53蛋白表达,抑制Survivin的蛋白表达水平,干扰上游Caspase-9的活化过程,同时激活下游Caspases途径,进一步启动级联反应激活凋亡通路下游的Caspase-3,促进细胞最终发生凋亡。