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随着人口的老龄化及人们整体生活方式的改变,2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus)的发病率呈现出飞速增长的趋势,并且已经成为危害全球公共健康问题的非感染性疾病之一。2型糖尿病是一种在多因素共同作用下所发生的疾病,其发病过程复杂,病因难以明确。2型糖尿病最为显著的特征是胰岛素抵抗和胰岛功能减退,从而导致了胰岛素的绝对或相对补足和胰岛素信号通路受阻。解偶联蛋白2(uncoupling protein 2),作为近些年来所发现的蛋白,是解偶联蛋白家族中的成员之一,其广泛分布于神经、肝脏、脂肪以及胰腺等组织中。其主要作用是通过转运线粒体中的质子,从而影响ATP/ADP的比例,导致ATP的数量相应减少。同时可作用于呼吸链影响活性氧的产生,发挥其生物学作用。有大量研究表明,解偶联蛋白通过改善氧化应激、细胞增殖等,而发挥其生物学作用,在治疗糖尿病及其并发症中也有一定的作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是近些年来研究比较多的有关DNA单个碱基缺失、转换、颠倒及插入,从而影响相关蛋白质功能的改变。根据相关统计,SNP在人类基因组的核苷酸中出现的概率是1/1000。SNP广泛的分布于人类整个基因组中,可在编码区、非编码区以及基因间区。有研究表明SNP通过影响编码区的碱基导致蛋白功能的改变。也有大量研究表明,SNP和脑血管疾病、2型糖尿病等疾病都有关系。但是由于种族及地区的不同,SNP的差异也非常大,特别是在有关2型糖尿病的研究中,其结果不尽相同。MicroRNA属于一类内源基因非编码的RNA,长度约22个核苷酸。到目前为止,已经在动物及病毒中发现多种miRNA,它们参与了机体转录后水平的基因表达调控。有研究表明MicroRNA通过其功能参与机体内的多种生物学功能,甚至在2型糖尿病的发病中也起到了一定的作用。然而因为MicroRNA的种类繁多,绝大多数MicroRNA的功能和作用机制尚不清楚。本研究旨在通过临床研究分析解偶联蛋白2的SNP与2型糖尿病的关系,并通过建立体内(动物)和体外(细胞)的胰岛素抵抗模型,深入研究解偶联蛋白2上游MicroRNA的调节作用,和解偶联蛋白2改善胰岛素抵抗的作用及其机制,探讨2型糖尿病发病机制及治疗新靶点。第一部分解偶联蛋白2基因多态性与2型糖尿病及其前期的相关性研究目的:本研究旨在探讨中国北方人群中解偶联蛋白2基因(UCP2)rs659366多态性与2型糖尿病前期和2型糖尿病之间的关系。方法:本研究是通过本院体检中心和内分泌科门诊合作招募志愿者,所有志愿者均经过常规查体和口服葡萄糖耐量实验:最终确定470名糖尿病前期患者、470名新诊断2型糖尿病患者以及536名健康对照组。单核苷酸多态性的检测采用连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR)技术。采用χ2检验和单因素方差分析比较基因型和等位基因分布差异,采用Tukey检验进行配对分析。结果:1.糖尿病前期患者的AA基因型频率(11%)显著高于对照组([OR]=1.83,95%[CI]=1.16-2.89,P<0.008)。2型糖尿病组GA(48%)和AA(15%)基因型较对照组显著升高(GA:OR=1.72,95%CI=1.32-2.24,P<0.001;AA:OR=3.05,95%CI=1.97-4.72,P<0.001)。2.与对照组相比较,在糖尿病前期和糖尿病组中A等位基因的频率(对照组27%,糖尿病前期33%和2型糖尿病39%)显著升高,并且明显增加了发生糖尿病前期(OR=1.33,95%CI=1.01-1.74,P<0.04)和2型糖尿病(OR=1.72,95%CI=1.32-2.24 P<0.001)的发病风险。3.此外,与GG和GA基因型相比,携带AA基因型糖尿病前期患者和T2DM患者的胰岛素水平显著降低。小结:UCP2 rs659366基因多态性可能参与了糖尿病形成的病理机制,导致2型糖尿病前期和T2DM发生风险增加。第二部分高脂诱导胰岛素抵抗小鼠胰腺组织miR-134-3p与UCP2表达变化目的:观察miR-134-3p在高脂诱导胰岛素抵抗小鼠血糖、胰岛素、QUICKI、血脂及胰腺脂质沉积的情况,以及对UCP2的调节作用。方法:将周龄为6周的C57BL/6J小鼠,按普通饲料喂养和高脂喂养随机分为对照组(CON,普通饲料)10只和高脂组(HFD,高脂饲料)12只。HFD组饲喂高脂饲料,CON组给予常规饲料饮食。8周后行腹腔注射糖耐量实验(IPGTT),评估小鼠胰岛素抵抗模型是否建立,分别检测0min、15min、30min、60min、120min时间段血糖数值,并且计算出葡萄糖曲线下面积(AUC)。采集小鼠FPG、TG、HDL-C以及LDL-C,采用酶联免疫吸附实验法(ELLSA)测定空腹胰岛素水平并且计算出胰岛素敏感性指数(QUICKI),并且检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、GSH(谷胱甘肽)、GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)。留取胰腺组织标本进行H&E染色,观察胰腺组织病理形态变化及脂质含量。并且通过实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定胰腺组织中解偶联蛋白2及miR-134-3p表达的水平。结果:1.高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗模型的建立高脂饮食干预从喂养的第二周起,HFD组较CON组小鼠的体重明显升高。8周末行IPGTT试验,HFD较CON组小鼠在0min、15min、30min、60min、120min时间点血糖水平明显升高,与CON组相比,HFD组葡萄糖曲线下面积显著增加,证明胰岛素抵抗模型建立成功。2.两组小鼠生化水平的比较HFD组与CON组相比较,TG、TC、LDL-C水平显著升高。且SOD、GSH、GSH-PX在CON组的水平明显高于HFD组。而MDA的水平与CON组比较,在HFD组是明显升高的。3.解偶联蛋白2和miR-134-3p的mRNA水平的比较荧光定量RT-PCR结果显示,与CON组比较,HFD组小鼠胰腺UCP2的mRNA表达水平显著降低;miR-134-3p的水平显著升高。4.两组小鼠胰腺形态组织学比较H&E染色,CON组可见胰腺组织结构清晰完整,胞浆均匀红染,脂滴空泡较少,未见明显脂肪变性;而在HFD组胰腺组织结构混乱模糊,在小鼠的胰腺细胞的胞浆内存在多个脂滴空泡(且大小空泡的体积大小不等),脂滴的存在对细胞核产生挤压,将其挤于细胞边缘,呈明显的脂肪变性。小结:1.高脂饮食可导致小鼠胰岛素抵抗及胰腺病理形态改变。2.胰岛素抵抗小鼠的胰腺组织解偶联蛋白2的mRNA表达减少;miR-134-3p表达增加。第三部分miR-134-3p靶向UCP2调控PI3K/Akt信号通路和氧化应激影响MIN6细胞胰岛素抵抗目的:观察miR-134-3p、UCP2对MIN6胰岛β细胞PI3K/Akt通路及胰岛素抵抗和氧化应激的影响。方法:建立棕榈酸诱导的MIN6细胞胰岛素抵抗模型,通过转染miR-134-3p的模拟物或者抑制物过表达或敲低MIN6细胞内miR-134-3p的表达,分组如下:(1):正常对照组(CON)、PA干预组(PA)、PA+miR-134模拟物组(miR-134-mimic)、PA+miR-134模拟物对照组(mimic-negative control,mimic-NC);(2):正常对照组(CON)、PA干预组(PA)、PA+miR-134抑制物组(miR-134-inhibitor)、PA+miR-134抑制物对照组(inhibitor-negative control,inhibitor-NC)。采用CCK8试剂盒测定培养细胞的活力;化学法测定转染后各组细胞培养液的葡萄糖浓度;用相关试剂盒测定细胞氧化应激相关指标(SOD、MDA、GSH、GSH-PX)的水平。提取各组细胞总RNA,实时荧光定量RT-PCR技术检测miR-134、UCP2、PI3K和AKT的表达水平。并且用Western blot技术检测UCP2、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达水平。结果:1.PA孵育构建MIN6细胞胰岛素抵抗模型通过PA孵育MIN6细胞24小时后,测定细胞培养基中葡萄糖的含量,PA组的葡萄糖浓度明显高于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。通过对PA组和对照组进行油红O染色,发现PA孵育的MIN6细胞脂滴沉积的情况较对照组明显增多。以上提示经PA孵育成功建立了MIN6小鼠胰岛β细胞胰岛素抵抗模型。2.转染效率转染后的miR-134-mimic组的miR-134-3p的表达水平较CON组显著升高(P<0.05),染而miR-134-inhibitor组的miR-134-3p的表达水平较CON组显著降低(P<0.05)。3.PA及miR-134-3p表达对MIN6 miR-134-3p、UCP2水平、PI3K/Akt通路及氧化应激相关分子表达的影响3.1 miR-134-3p过表达/下调对UCP2和PI3K/Akt转录水平的影响在PA组中MIN6细胞UCP2、PI3K和AKT的mRNA表达水平较CON组,表达量下降(P<0.05);miR-134-3p mimic转染后,与mimic-NC组比较,UCP2、PI3K及AKT的mRNA表达水平进一步下降(P<0.05);miR-134-3p inhibitor转染后,与inhibitor-NC组比较,上述指标的表达水平均升高(P<0.05)。3.2 miR-134-3p过表达/下调对UCP2和PI3K/Akt蛋白水平的影响在PA干预组中PI3K及AKT的总蛋白量的表达与Con组相比较无明显变化,但磷酸化的PI3K和AKT以及解偶联蛋白2的表达水平降低,并且差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-134-3p mimic转染后,与mimic-NC组比较,miR-134-mimic组的PI3K及AKT总蛋白的表达无明显变化;但磷酸化的PI3K和AKT以及UCP2的表达水平呈现出下降的趋势;miR-134-3p inhibitor转染后,与inhibitor-NC组相比较,PI3K及AKT总蛋白的表达无明显变化;但磷酸化的PI3K和AKT以及UCP2的表达水平均升高。4.miR-134的水平对氧化应激指标的影响在PA干预组中与Con组相比,MDA、SOD、GSH-XP的水平降低(P<0.05);miR-134-3p转染后,与mimic-NC组比较,miR-134-3p组MDA、SOD、GSH-XP的水平进一步降低(P<0.05);miR-134-3p inhibitor转染后,inhibitor-NC组相比较,MDA、SOD、GSH-XP的水平升高(P<0.05)。小结:1.PA孵育可导致MIN6胰岛β细胞脂质沉积和胰岛素抵抗。2.miR-134-3p可靶向抑制UCP2表达,调控PI3K/Akt通路,影响MIN6胰岛β细胞氧化应激和胰岛素抵抗。结论:1.解偶联蛋白2 rs65936基因多态性与2型糖尿病及其糖尿病前期的发生发展密切相关。2.高脂饮食可导致小鼠胰岛素抵抗和氧化应激,以及胰腺miR-134-3p表达增加、解偶联蛋白2表达降低。3.miR-134-3p可靶向抑制UCP2表达,调控PI3K/Akt通路,影响MIN6胰岛β细胞氧化应激和胰岛素抵抗。