目的 实体肿瘤的生长、代谢及转移需要持续的血管生成。在众多的新生血管诱生剂中，血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是促进肿瘤血管生成最重要的因子之一。近年来的研究证明VEGF主要是通过与其特异的受体—KDR(kinase insert domain-containing receptor)结合发挥作用的。KDR属于细胞表面酪氨酸激酶受体，多在内皮细胞中表达，但在其它组织细胞中也可检测到KDR的表达，如巨噬细胞、某些血液细胞和肿瘤组织细胞。本研究用RT-PCR结合计算机条带密度半定量分析方法，检测80例不同卵巢组织中KDR mRNA的表达水平，及KDR mRNA的表达与卵巢浆液性癌(Ovarian Serous Carcinoma，OSC)临床病理特征的关系，探讨KDR mRNA表达在卵巢上皮性浆液性肿瘤尤其是OSC发生、发展中的意义，为今后从分子水平干预肿瘤血管增生，进而预防卵巢癌转移、复发提供依据。 资料与方法 一、资料来源 选取2000年3月至2002年3月，在中国医科大学第一、二临床学院妇产科行手术切除卵巢上皮性浆液性肿瘤的组织标本70例，包括卵巢浆液性癌30例、卵巢交界性浆液性瘤10例、卵巢良性浆液性瘤30例。选用来自全子宫切除同时行卵巢切除的10例正常卵巢组织作为对照。患者年龄20～70岁，平均43.1岁。标本采取后，迅速置于液氮中冷冻，然后送于-70℃冰箱中保存。同时将标本送病理，经两位病理专家阅片后确定病理学诊断。30例卵巢浆液性癌均有完整的临床病理资料。其中FIGO分期(1986年）I、11期8例，皿、Rr期22例；组织学分级高分化8例，中、低分化22例；腹腔液细胞学检查阳性24例；淋巴结转移14例；伴盆腔粘连20例。 二、主要试剂 提取总RNA的TRIzol试剂为美国Promega公司产品。RT－PCR试剂盒由日本TaRaKa公司提供。引物由北京奥科生物有限责任公司合成。电泳用琼脂糖由沈阳联星生物公司提供。 三、方法 1．总RNA提取：采用TRIzol一步抽提法。RNA纯度采用紫夕透射仪测定 OD值，OD260人80值为 l．6－2．0。 2．逆转录合成 CDNA：在 20…反应体系中分别加人样本 RNAZpl；Buffer（xZ）10pl；MxSO。（二．srnmoUL）4叫；dNTPs（10mmOU）lpl；RNase一I讪ibitor（40y卜）0．spl；AMV lgl；Oligo dT（50卜mol）…l；ddH，O 0．5 pl，［J 90℃孵育 3 min，42℃30min合成 cDNA。 3．PCR扩增和产物分析： KDR书《chn基因引物和扩增片段长度见论文正文。 KDR PCR反应体系；cDNA产物 3叫、弓物各 0．05…、B咖r（x 10）2．541、dNWs（10nunoVL）Zgl、Taq酶 0．Zgl、ddH。O17．2…，95℃905预变性，进入循环，94℃455变性，59℃455退火，72℃90s复性，35个循环后，72℃10ndn延伸。另一反应体系中同时扩增和achn作为内对照。 将PCR扩增产物10gi用含0．sp矿nl4化乙锭（EB）的2％琼脂糖凝胶电泳检测，电压100y，时间lh，然后在紫外透射仪上观察，最后用 KODAK成像分析系统确定KDR InRNA各扩增带的相对含量。实验中以 diX174－Hic 11 DNA M毗er作为分子量标准，以结肠癌KDR mRNA提取物作为阳性对照，以蒸馏水代替mRNA提取物作为空白对照，以p吃ctin作为内对照。 4．结果判断； ·2· 与Marker相比较有555hP条带及内对照690hP条带同时显示者，判断为表达阳性。仅有内对照690hp条带显示者判断为表达阴性。用内对照吸光度值标化KDR吸光度值，得到KDR的相对含量，具体计算公式为：DbR＝DKI）R／D。一 XI皿。 5．统计学处理：用SppS10．0软件对实验结果进行统计学分析。KDR mRNA表达率采用 Fsher’s精确概率法和 X‘检验；相对含量采用方差分析和z检验。 实验结果 一、KDR mRNA在各种卵巢组织中的表达情况 KDR InRNA在四种组织中均可表达。卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤组织中 KDR 1llnixA的表达率分别与卵巢良性浆液性瘤组织比较，均有非常显著性的差异u＜0．01厂与正常卵巢组织比较，亦有显著性差异（P＜o．05人卵巢浆液性癌组织中KDR mRNA表达率与卵巢交界性浆液性瘤组织比较，差异无显著性（P＞O．05人 卵巢良性浆液性瘤组织与正常卵巢组织＊＊Rm RNRNA表达率之间的比较亦无显著差异（P＞O．05人卵巢浆液性癌组织中 KDR mRNA的相对含量明显高于其它三组，经统计学分析，其差异显著门＜0．05人而其它三组之间KD R m RNRNA相对含量之间比较均无明显差异河＞0．05人 二人DR mRNA表达与 OSC临床病理特征的关系 皿、w期 OSC组KDR m洲A的表达率及相对含量与 1、H期组比较，差异显著（P＜0．05人腹腔液细胞学检查阳性组＊＊RInRN A的表达率及相对含量与阴性组比较，差异亦显著（P＜队 05人有淋巴结转移组 KDR mRNA的表达率及相对含量与无淋巴结转移组比较，差异非常显著河＜o．01八有盆腔粘连组＊＊RInRN A表达率及相对含量与无粘连组比较，差异亦显著司＜O．05人而在不同的组织学分级及腹腔积液量中