研究背景冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称,亦称为缺血性心脏病。心血管疾病是目前导致人类死亡与残疾的三大主要疾病之首,严重危害人类健康。祖国医学虽无冠心病的病名,但根据症状多属于中医学的“胸痹”、“真心痛”、“厥心痛”等范畴。冠心病中医证型按虚实均可归为本虚标实、本虚和标实三大类。本虚标实属常见证型,近年我国人民生活方式的改变导致气虚、血瘀两种证候要素在冠心病证候要素中所占比例逐渐升高。目前对于冠心病气虚血瘀证动物模型的研究已经有了一些进展,但在造模方法以及模型评价体系上仍然不够成熟与临床差距较大,尚无公认的标准的规范化的模型建立和评价方法。研究冠心病气虚血证的发病机制和其证候的物质基础急需建立一种稳定性高、重复性好的动物模型。本实验室在建立各类动物模型的探索过程当中,逐步形成了“病证结合动物模型拟临床”这一概念,并在其指导下成功建立十余种病证结合动物模型,因此本课题在前人研究的基础上进一步探索冠心病气虚血瘀证动物模型的建立并构建其评价体系。本研究对于揭示中医证候物质基础,开发治疗冠心病的新药和有效中药的筛选,阐明中药复方作用机制具有十分重要的理论和应用意义。第一部分：冠心凸病气虚血瘀证病证结合大鼠模型建立方法的探索1.研究目的通过不同模型建立方法比较确立稳定的冠心病气虚血瘀证大鼠模型的建立方法。2.材料和方法选用雄性WISTAR大鼠随机分6组:A.空白组(CON)：正常饮食饮水n=8；B.假手术组(SHAM):开胸、穿线但不结扎n=8;C.单纯结扎冠脉模型组(L)：正常饲养2周后单纯结扎左冠状动脉前降支n=8;D.多因素复合模型组：d1：疲劳运动复合结扎冠脉模型组(EL)：疲劳运动2周+结扎冠脉,手术恢复3天后维持大鼠力竭运动(1次/2天)n=8；d2:控食复合结扎冠脉模型组(DL)：控食2周+结扎冠脉,手术恢复3天后继续控制饮食n=7；d3：控食、疲劳运动双因素复合结扎冠脉模型组(DEL)：控食2周+疲劳运动2周+结扎冠脉,手术恢复3天后维持大鼠力竭运动(1次/2天),控制饮食n=5。6周造模结束后观察大鼠宏观体征,分别采集大鼠超声心动检测指标、呼吸幅度对大鼠冠心病气虚血瘀证的主症进行评价；采集空场实验相关指标、力竭运动时间、足底图像色彩饱和度对兼症进行评价；采集舌面色彩饱和度对舌象进行评价；采集脉搏搏动幅度对脉象进行评价。同时对心脏结构与功能、血管内皮功能、能量代谢水平、心肌组织病理检查等相关指标进行检测。3.研究结果3.1.1一般情况：DL、EL、DEL与SHAM比较体重分别下降38.3%、10.6%、45.3%(P<0.01),L与SHAM比较体重下降2.6%(P>0.05)；DL、EL、DEL与L比较体重分别显著下降36.6%、8.2%、43.9%(P<0.05 P<0.01)。3.1.2心脏结构与功能：DL、EL、DEL、L与SHAM比较射血分数分别下降71.4%、62.4%、71.6%、49.4%(P<0.01),短轴缩短率分别下降77.2%、69.2%、77.5%、57.9%(P<0.01),左室舒张末内径分别扩大29.2%、36.6%、31.7%、19.8%(P<0.01),左室收缩末内径分别扩大123.9%、122.6%、124.4%、83.6%(P<0.01),左室舒张末容积分别扩张76.7%、99.3%、83.7%、50.7%(P<0.01),左室收缩末容积分别扩张525.7%、515.9%、522.6%、303.8%(P<0.01)；DL、DEL与L比较短轴缩短率分别显著下降45.9%、46.6%(P<0.01),EL与L比较短轴缩短率下降26.9%(P>0.05),DL、EL、DEL与L比较射血分数分别下降43.4%、25.6%、43.9%(P<0.05 P<0.01),左室舒张末内径分别扩大7.8%、14%、9.9%(P<0.05 P<0.01),左室收缩末内径分别扩大22%、21.2%、22.2%(P<0.01)左室舒张末容积分别扩张17.3%、32.3%、21.9%(P<0.05 P<0.01),左室收缩末容积分别扩张55%、52.5%、54.2%(P>0.05)3.1.3生物学相关指标：四种模型与SHAM比较血清BNP、NT-proBNP、ET、 ATP synthase含量升高(P<0.05 P<0.01),NO含量下降(P<0.01)。DL、EL、DEL与SHAM比较6Keto-PGF1α/TXB2比值下降(P<0.05 P<0.01),L与SHAM比较6Keto-PGF1α/TXB2比值下降(P>0.05)。DL、EL、DEL与L比较BNP、ET、ATP synthase含量升高(P<0.01),NO含量、6Keto-PGF1α/TXB2比值下降(P<0.01)。3.1.4心肌病理组织观察：心肌MASSON、HE染色和电镜观察,CON、SHAM组心肌组织正常,其余模型组心肌出现不同程度病理性改变。3.1.5证候特征表现：与SHAM比较,L主症有表现,EL、DL、DEL主症表现明显,相关指标发生显著改变(P<0.05 P<0.01)；L、EL兼症有表现,DL、 DEL兼症表现明显,空场实验相关指标、力竭运动时间、足底色彩饱和度发生显著改变(P<0.05 P<0.01)；四个模型组与SHAM比较舌象发生改变(P<0.05P<0.01),DEL改变最明显；四个模型组与SHAM比较脉象发生改变(P<0.05P<0.01),DL、EL、DEL改变明显。4.结论(1)纯单纯结扎冠脉方法(L)以及多因素复合方法(DL、EL、DEL)都可以成功建立冠心病气虚血瘀证大鼠模型。(2)采用复合因素建立的模型(DL、EL、DEL)与通过单纯结扎冠脉建立的模型(L)比较临床病因学基础以及与中医相关理论体系的联系更密切,在完整体现中医证候的特征方面具有一定的优势。(3)三种复合因素建立的模型当中,通过疲劳运动复合结扎冠脉(EL)的方法建立的模型与其他两种方法建立的模型(DL、DEL)比较更符合临床实际发病的原因与特征,是一种条件可控、重复性好的冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型。第二部分：冠心病气虚血瘀证发展过程研究及益气活血药的干预作用1.研究目的通过动态观察模型建立的三个不同阶段研究疾病发展过程并利用益气活血药对大鼠模型进行干预,进一步探讨模型建立方法的可靠性和稳定性。2.材料和方法选用雄性WISTAR大鼠随机分11组,第一个阶段为造模2周,大鼠分为3组：A.空白组(CON2) n=8; B.疲劳运动模型组(M2)n=7；C.药物反证组(D2)：双参通冠方22.5mg/kg,造模同时给药,持续2周n=8。第二个阶段为造模4周,大鼠分为4组,每组8只：A.空白组(CON4)；B.假手术组(SHAM4); C.疲劳运动复合结扎冠脉模型组(M4)；D.药物反证组(D4)：双参通冠方22.5mg/kg,冠脉结扎24小时后给药,持续2周。第三个阶段为造模6周,大鼠分为4组,每组8只：A.空白组(CON6)；B.假手术组(SHAM6)C.疲劳运动复合结扎冠脉模型组(M6)；D.药物反证组(D6)：双参通冠方22.5mg/kg,冠脉结扎24小时后给药,持续4周。各阶段结束后大鼠指标检测方法与第一部分实验相同。3.研究结果：3.1.1一般情况：造模2周,M2与CON2比较体重下降12.5%(P<0.01)；D2与M2比较体重上升10.7%(P<0.05)。造模4周,M4与SHAM4比较体重下降14.4%(P<0.05)；D4与M4比较体重上升11%(P>0.05)。造模6周,M6与SHAM6比较体重下降10.6%(P<0.01)；D6与M6比较体重上升8.3%(P<0.05)。3.1.2心脏结构与功能：造模2周,M2与CON2比较射血分数、短轴缩短率分别下降7.6%、10.9%(P>0.05),左室舒张末内径下降6.2%(P<0.01),左室舒张末容积下降13.6%(P<0.01)；D2与M2比较射血分数、短轴缩短率、左室舒张末内径、左室舒张末容积分别上升5.6%、8.6%、3.9%、9%(P>0.05)造模4周,M4与SHAM4比较射血分数、短轴缩短率分别下降46.1%、54%(P<0.01),左室舒张末内径、左室收缩末内径分别上升27.4%、78.2%(P<0.01),左室舒张末容积、左室收缩末容积分别上升71.2%、267.2%(P<0.01)；D4与M4比较射血分数、短轴缩短率分别上升6.9%、8.2%(P>0.05),左室舒张末内径下降6.2%(P<0.05),左室收缩末内径下降7.1%(P>0.05),左室舒张末容积、左室收缩末容积分别下降12.7%、14%(P>0.05)。造模6周,M6与SHAM6比较射血分数、短轴缩短率分别下降54.5%、60.1%(P<0.01),左室舒张末内径、左室收缩末内径分别上升20.9%、70.1%(P<0.01),左室舒张末容积、左室收缩末容积分别上升53%、243.5%(P<0.05 P<0.01)；D6与M6比较射血分数、短轴缩短率分别上升28.9%、29.4%(P>0.05),左室舒张末内径、左室收缩末内径分别下降0.6%、7%(P>0.05),左室舒张末容积、左室收缩末容积分别下降1.4%、17.4%(P>0.05)。3.1.3生物学相关指标：造模2周、4周、6周后,M与对照组比较血清ET、BNP、NT-proBNP、ATP synthase含量升高(P<0.01),血清NO含量下降(P<0.01)；D与M比较血清ET、BNP、NT-proBNP、ATP synthase含量下降(P<0.01),NO含量升高(P<0.01)。3.1.4心肌病理组织观察：心肌MASSON、HE染色和电镜观察,造模2周、4周、6周后CON、SHAM组心肌组织正常,M组心肌出现不同程度病理性改变。D组心肌改变介于CON组与M组之间,病理性改变程度减轻。3.1.5证候特征表现：随着造模时间延长,模型主症、兼症、舌象、脉象的表现愈加明显。双参通冠方治疗能够明显改善造模2周、4周、6周部分主症表现；能够改善造模2周、4周、6周部分兼症表现,6周时作用明显；能够明显改善造模2周、4周、6周脉象表现；对舌象无明显改善作用。4.结论(1)造模2周后,通过跑台建立的运动疲劳模型开始表现出气虚血瘀证的相关症候；4周后,冠心病大鼠模型气虚血瘀证相关症候表现更加明显；6周后,冠心病大鼠模型可以辨证为气虚血瘀证。(2)冠心病气虚血瘀证发展过程当中能量代谢出现异常,对心肌细胞产生损伤；冠脉损伤后内皮细胞的破坏对血管正常功能的维持产生了不良影响；随着病变时间的延长,心肌损伤进一步加重,导致心肌梗死的发生,心肌组织出现的严重病变影响心脏的收缩功能。(3)双参通冠方对冠心病气虚血瘀证大鼠运动耐受力、血管内皮功能、能量代谢水平均有一定程度的改善。综上所述,本文在通过对比四种不同模型建立方法后得出一种可靠的稳定的冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型建立方法的基础上,动态观察其病理演化过程并利用双参通冠方进行干预,对模型建立的可靠性及双参通冠方的药效进行了验证。