乙酰胆碱酯酶(EC3.1.1.7,AChE),是中枢神经系统的关键酶,它的主要功能是在神经突触处通过催化水解神经递质乙酰胆碱(Ach),调节Ach的水平从而终止神经冲动。AChE是由AChE基因(ace)编码的,它是有机磷(OP)和氨基甲酸酯(CB)类农药的主要作用靶标。人们已经从数十种脊椎动物和无脊椎动物中克隆了AChE的编码序列。大多数昆虫的AChE是由两种AChE基因(ace)编码的。尽管在基因克隆方面做了大量的工作,但对两种AChE功能的研究较少,两种AChE的具体生物学作用仍不明确。本论文主要做了如下研究:　　 1、不同蚕品种的两种类型ace多态性及对农药的敏感性研究　　 中国有1000多种家蚕品种种质资源,而且家蚕受到的农药污染相对较少,这为ace多样性研究提供了好的材料。本研究测定了有代表性的24个品种家蚕对农药毒死蜱和残杀威的生物活性,比较了这24个品种家蚕AChE的比活力;克隆了31个品种家蚕两种AChE的全长cDNA序列,对其氨基酸序列进行了突变位点分析,并对31品种家蚕的核苷酸序列进行了进化分析。农药生物活性测定结果表明,不同家蚕品种对不同的农药具有不同的敏感性;纯化的家蚕AChE的比活力分析表明,不同品种家蚕的AChE具有不同的比活力,酶的比活力和农药敏感性没有直接的相关性。对31个品种家蚕的氨基酸突变位点进行序列联配分析发现,已克隆测序的31个1型ace ORF中有63氨基酸点突变,而已克隆的31个2型ace中仅有13个氨基酸点突变,由此可知家蚕2型ace相对保守。根据不同品种家蚕的核苷酸序列构建了两种AChE的进化树,结果表明,两种AChE在进化关系上是独立发生的。　　 2、蚕两种ace在不同发育阶段的差异表达及RNAi干扰研究　　 通过实时荧光定量PCR技术,分析了家蚕蚕卵和幼虫不同发育时期两种AChE mRNA表达水平的变化;通过RNAi技术,研究了喂食两种AChE dsRNA对家蚕AChE mRNA表达水平的影响。结果表明,在卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫时期,家蚕的2型AChE的表达水平明显高于1型AChE,而在4龄和5龄幼虫中,两种AChE的表达水平相似;在幼虫期,两种AChE的表达水平呈下降趋势。RNAi研究表明,给家蚕幼虫喂食两种类型AChE基因的dsRNA都能使家蚕幼虫的发育延迟,最终导致家蚕死亡。Realtime PCR分析表明,RNAi降低了两种类型AChE mRNA的表达水平。　　 3、蚕两种ace克隆及其编码蛋白的催化特性和抑制动力学比较　　 在我们已经克隆和表达家蚕两种类型的ace基础上,本研究进一步克隆了家蚕的祖先--野蚕的两种类型的ace的全长cDNA序列;在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中高效表达了这两种ACHE;比较了这两种AChE的催化特性以及两种AChE对OP和CB类杀虫剂的敏感性。两种AChE的底物专一性和对选择性抑制剂的敏感性分析表明,两种重组AChE均具有高度的专一性和较高效的催化活性。酶动力学分析表明,1型AChE对ATC、BTC、和PTC的水解速率(Vmax)分别是2型AChE的2.78、8.27、1.3倍。杀虫剂抑制动力学分析表明,在9种OP和CB类农药中,1型AChE对其中8种更敏感,但2型对其中的庚烯磷农药更敏感。通过序列联配分析表明,这些敏感性的差异可能是由于两种酶的周边位点差异引起的。两种AChE的酶学和抑制剂敏感性差异为设计新型的选择性农药的提供了理论基础。　　 4、蚕追寄蝇ace的克隆,抗性相关点突变分析及其与宿主蚕2种AChE抑制动力学比较　　 追寄蝇Exorista sorbillans(Diptera:Tachinidae)是家蚕的重要寄生害虫,给蚕业造成很大损失。灭蚕蝇是一种用来防治家蚕寄生蝇的OP农药,其选择性杀灭追寄蝇机理仍不明确。由于长期使用,灭蚕蝇等农药已经出现抗性问题,其抗性机制也有待解明。本研究首次克隆并表达了家蚕追寄蝇的ace,发现了一个与抗性相关的点突变(Gly353Ala,对应酶分别缩写为Es-353G-AChE和Es-353A-AChE)。本研究将Es-353G-AChE和Es-353A-AChE基因在昆虫细胞杆状病毒表达系统中进行了高效表达,通过对Es-353G-AChE和Es-353A-AChE的抑制动力学进行比较,确认该位点的突变与农药的敏感性性有关。同时,将表达的追寄蝇的AChE与其宿主(家蚕)的两种类型AChE进行抑制动力学比较发现,追寄蝇的AChE对农药更敏感,这为OP农药的选择性杀灭寄生蝇机理提供了一种深入的解释。　　 5、利用生物反应器大量表达AChE研究　　 通常,农药检测是依托GC,LC,GC-MS或者LC-MS等技术建立起来的,其灵敏度较高,但耗费时间长、样品准备复杂、需要专业的仪器支持,因此开发一种快速、高效、成本低的检测方法实属必要。本研究克隆了家蝇敏感品系的AChE基因,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统高效表达了该基因;运用生物反应器,建立了规模表达的方法;通过过硫酸铵沉淀,亲和层析的方法对表达的蛋白进行纯化,从1L表达产物中获得了4.2mg重组蛋白,该重组蛋白的酶活力为118.9 U/mg,最适温度为37℃,最适pH值为7.6;该重组蛋白对OP和CB类农药高度敏感,可用于进行农药检测。本研究建立了一种规模化生产、纯化重组AChE,并将其用于农药监测的新方法。