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丙烯酰胺(acrylamide,ACR)是一种水溶性烯烃,作为化工原料生产聚丙烯酰胺。ACR的神经毒性在人群流行病学研究中得到充分验证。慢性ACR中毒患者的主要临床表现为:手掌多汗蜕皮、四肢麻木、跟腱反射减弱或消失等。在电镜下肿胀的轴突末端微管(microtubules,MT)数量异常,但ACR导致MT损伤的机制不清楚。微管相关蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)中最丰富的是MAP2,MAP2最主要的功能是参与调节MT的组装过程。钙蛋白酶(Calpain)是一类依赖于Ca2+激活的中性半胱氨酸水解酶,它具有水解信号酶、细胞骨架蛋白(MAP2和Tau)和膜蛋白的功能,并且与神经病的发生发展有关。Calpeptin(CP)作为一种人工合成的肽类Calpain抑制剂,具有高效性、特异性及细胞渗透性好等优点,与Calpain的活力位点结合,可逆的抑制Calpain的活力。假设由ACR诱导的MT损伤与calpain活力升高,MAP2降解有关。目的为了验证ACR诱导的MT损伤与calpain活力升高和MAP2降解有关这个假设,探索CP对ACR中毒大鼠MT损伤的干预作用及机制,为ACR中毒的预防与治疗提供依据。方法1.动物处理:适应性饲养后将Wistar大鼠随机分为4组(每组10只),分别记为对照组、CP组、ACR组、ACR+CP组。对照组的大鼠腹腔注射(intraperitoneal,i.p.)给予生理盐水;CP组的大鼠给予CP2000μg/kg(i.p.);ACR和ACR+CP组的大鼠给予ACR30 mg/kg(i.p.),给予ACR 1小时后,ACR+CP组给予CP200μg/kg(i.p.)。ACR隔天染毒,3次/周,共4周。CP隔天干预,早晨和晚上各一次,6次/周,共4周。将ACR溶于0.9%的生理盐水中(浓度为30mg/ml)并以1ml/kg给予大鼠。2.体重及神经行为功能观察:在染毒期间,每周测量体重、后肢撑力、加速转棒试验和步态评分。3.组织形态观察:进行HE染色以在光学显微镜下观察脊髓切片的形态变化。4.免疫组化法分析蛋白表达:应用免疫组织化学方法在光学显微镜下观察m-calpain、μ-calpain、MAP2、α-tubulin和β-tubulin蛋白在脊髓中的表达。5.免疫印迹法蛋白半定量:应用凝胶电泳和半定量免疫印迹方法,对脊髓中m-calpain、μ-calpain、MAP2、α-tubulin和β-tubulin蛋白含量进行半定量分析。6.统计方法:所有实验数据以平均值±标准差(X±s)表示。步态评分的数据用Mann-Whitney U test分析,其它的数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析,组间两两比较采用LSD法进行分析。结果1.体重对照组与CP组4周之间基本相似不变;与对照组相比,自第2周开始,ACR组的大鼠体重下降了 5.6%(P<0.05),随着染毒的继续,这种趋势更加明显,到第4周时,ACR组的大鼠体重下降了 8.8%(P<0.01);与ACR组相比,自第3周开始,ACR+CP组的大鼠体重增加了4.2%(P<0.05),到第4周时,ACR+CP组的大鼠体重增加了6.2%(P<0.01),且与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。2.行为学指标(1)后肢撑力:对照组与CP组4周之间基本相似不变;与对照组相比,自第2周开始,ACR组的大鼠后肢展宽增加了 26.9%(P<0.01),随着染毒的继续,这种趋势更加明显,到第4周时,ACR组的大鼠后肢展宽增加了34.4%(P<0.01);与ACR组相比,自第3周开始,ACR+CP组的大鼠后肢展宽降低了15.9%(P<0.01),到第4周时,ACR+CP组的大鼠后肢展宽降低了 16.3%(P<0.01),且与对照组比较仍有显著性差异(p<0.05)。(2)加速转棒试验:对照组与CP组4周之间基本相似不变。与对照组相比,自第3周开始,ACR组的大鼠潜伏期下降了27.0%(P<0.01),随着染毒的继续,这种趋势更加明显,到第4周时,ACR组的大鼠潜伏期下降了 61.7%(P<0.01);与ACR组相比,自第3周开始,ACR+CP组的大鼠潜伏期增加了20.2%(P<0.01),到第4周时,ACR+CP组的大鼠潜伏期增加了 70.7%(P<0.01),且与对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。(3)步态评分:对照组与CP组4周之间基本相似不变。与对照组相比,自第2周开始,ACR组的大鼠步态评分增加了 40%(P<0.05),随着染毒的继续,这种趋势更加明显,到第4周时,ACR组的大鼠步态评分增加了 150%(P<0.01);与ACR组相比,自第3周开始,ACR+CP组的大鼠步态评分降低了35%(P<0.05),到第4周时,ACR+CP组的大鼠步态评分降低了32%(P<0.05),且与对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。3.组织病理在染毒终点,对照组和CP组大鼠的脊髓组织形态正常,组织结构完整;运动神经元的细胞核主要位于细胞中央,核仁清晰。但是ACR组脊髓组织排列疏松,囊泡状改变;运动神经元数目减少,部分细胞核固缩,核仁溶解甚至消失。与ACR组相比较,ACR+CP组的运动神经元形态趋于正常,数量略有增加,但仍没有恢复到对照组的正常水平。4.免疫组织化学与对照组相比,μ-calpain在ACR组和ACR+CP组表达无明显差异。与对照组相比,m-calpain在ACR组过度表达,与ACR组相比,ACR+CP组中m-calpain的表达降低。与对照组相比,MAP2在ACR组表达减少,与ACR组相比,ACR+CP组中MAP2的表达增加。与对照组相比,α-tubulin在ACR组和ACR+CP组表达无明显差异。与对照组相比,β-tubulin在ACR组过度表达,与ACR组相比,ACR+CP组中β-tubulin的表达减少。5.免疫印迹法蛋白半定量(1)Calpain与对照组相比,CP组、ACR组和ACR+CP组U-calpain含量的变化差别没有统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,CP组m-calpain含量的变化差别没有统计学意义(P>0.05),ACR组的m-calpain含量增加了41.7%(P<0.01),ACR+CP组的m-calpain含量增加了 14.6%(P<0.05);然而与ACR组相比,ACR+CP组的m-calpain含量降低了 19.1%(P<0.01)。(2)MAP2与对照组相比,CP组MAP2含量的变化差别没有统计学意义(P>0.05),ACR组MAP2的含量下降了43.4%(P<0.01)。然而与ACR组相比,ACR+CP组的MAP2含量上升了 67.5%(P<0.01)。(3)MT与对照组相比,CP组、ACR组和ACR+CP组α-tubulin含量的变化差别没有统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,CP组β-tubulin含量的变化差别没有统计学意义(P>0.05),ACR组β-tubulin的含量增加23%(P<0.01);与ACR组相比,ACR+CP组β-tubulin的含量降低13.1%(P<0.05)。结论1.ACR诱导的MT损伤与calpain活力升高和MAP2降解有关,这可能是ACR诱导的MT损伤的机制之一。2.CP通过改变calpain和MAP2干预由ACR引起的MT损伤。