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肝硬化发病机制复杂,包括慢性乙型肝炎病毒、非酒精性脂肪性肝炎和肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration,HLD）。HLD是一种以铜代谢失衡为特征的常染色体隐性遗传病,对肝线粒体的完整性和功能有不良影响。线粒体损伤致能量代谢受损及胆固醇生物合成相关基因的减少,两者均可诱发肝纤维化,并导致肝硬化和门静脉高压,继发食管胃底静脉破裂出血、脾大和脾功能亢进（以下简称脾亢）,往往需要外科干预。本课题在前期研究基础上,及对临床确诊HLD肝硬化患者糖脂代谢异常现象的观察,进而对该类患者肝脏组织进行转录组学研究,明确糖脂代谢异常的生化代谢通路和信号转导通路。并建立LX-2细胞肝纤维化模型以及健脾活血中药干预,探求健脾活血中药改善肝纤维化的机制,为HLD合并门静脉高压症和脾亢患者的中西医结合治疗提供新治疗策略和方案。目的:通过分析HLD肝硬化患者临床资料及对转录组学的研究,明确参与HLD患者的糖脂代谢及其影响肝纤维化形成的信号通路及机制。使用健脾活血中药干预LX-2细胞肝硬化模型,探讨健脾活血中药对肝纤维化的逆转机制,为其临床应用提供实验依据。方法:1.HLD肝硬化患者糖脂代谢异常现象的发现收集安徽中医药大学第一附属医院普外科2020年1月至2021年12月收治的236例HLD肝硬化患者的临床资料,282例乙型肝炎（Hepatitis B virus,HBV）肝硬化患者临床资料。分析两组肝硬化患者的糖脂相关指标差异情况;同时分别收集5例HLD肝硬化脾切除术、5例HBV肝硬化脾切除术以及5例肝血管瘤（NOR）切除术中的肝脏组织,Masson染色观察肝组织病理形态变化,PAS染色观察组织糖原分布情况,糖原检测组织的糖原含量。2.HLD肝硬化患者转录组学研究对第一部分研究的肝组织进行Small RNA测序,分析测序数据,采用Top GO软件进行GO功能分析,并根据京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,KEGG）数据库,分析差异表达mi RNA的靶基因主要参与的生化代谢通路和信号转导通路;采用Western blot检测HLD患者特异性激活的信号通路相关蛋白YAP＆p-YAP,SREBP-1,SREBP-2、AMPK＆p-AMPK的表达量。3.健脾活血中药干预肝纤维化糖脂代谢异常分子机制TGF-β1诱导建立LX-2细胞肝纤维化模型,免疫荧光染色、Western blot检测肝纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen I、Desmin、Timp-1的分布和表达;RT-q PCR检测肝纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen I、Desmin、Timp-1 m RNA的表达;筛选中药最佳作用浓度,中药干预LX-2细胞模型,Western blot检测肝纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen I、Desmin、Timp-1的表达量;Hippo信号通路相关蛋白Yap＆p-YAP、TAZ＆p-TAZ及AMPK信号通路相关蛋白AMPK＆p-AMPK的表达量。结果:1.HLD肝硬化患者糖脂代谢异常现象的发现HLD患者的胆囊炎和胆结石的发病率分别为49.53%和14.24%,都显著高于肝炎肝硬化组的7.79%、9.12%。HLD患者血糖升高的发病率为8.47%,显著低于肝炎肝硬化组的14.89%,说明HLD患者的糖代谢和脂代谢都存在异常情况。Masson染色结果显示与肝炎肝硬化组比较,肝豆状核变性组患者肝脏组织有相似的肝硬化程度,且肝细胞被纤维组织分离成假小叶,其中央静脉错位或有缺乏纤维组织增生伴炎症细胞浸润,Scheuer分级为S4。肝血管瘤组的肝脏组织为正常肝脏组织。糖原检测显示HLD患者肝脏组织的糖原显著高于肝炎肝硬化患者和肝血管瘤患者,且糖原PAS染色结果显示HLD患者肝脏组织中的紫红色团块明显多于肝炎肝硬化患者的肝脏组织,说明HLD患者肝脏组织中糖原的含量显著多于肝炎肝硬化患者。2.肝豆状核变性患者的转录组学研究HLD患者与肝血管瘤患者肝脏组织mi RNA相比,筛选出28个差异表达的mi RNA,且差异表达的mi RNA的生物信息学分析在Hippo信号通路显著富集;HLD患者与肝炎肝硬化患者肝组织mi RNA相比,筛选出56个差异表达的mi RNA,其在AMPK信号通路显著富集。Western blot结果显示,与肝血管瘤组和肝炎肝硬化组相比,HLD患者肝组织的Hippo信号通路相关蛋白p-YAP与YAP比值显著低于其他组,而AMPK信号通路相关蛋白p-AMPK与AMPK比值显著高于其他组;HBV肝组织的Hippo信号通路相关蛋白p-YAP与YAP比值显著高于其他组,而AMPK信号通路相关蛋白p-AMPK与AMPK比值显著高于NOR组;患者HLD和HBV组Hippo通路下游基因SREBP-2的表达量显著高于NOR组和HBV组;而SREBP-1的表达量则显著低于NOR组和HBV组。3.健脾活血中药干预肝纤维化糖脂代谢异常分子机制TGF-β1诱导LX-2细胞建立肝细胞肝硬化模型,免疫荧光、Western blot、RT-q PCR结果均显示与肝硬化相关指标α-SMA、Collagen I、Desmin、Timp-1显著上升,说明模型建立成功。CCK-8筛选中药较好的作用浓度为0.625mg/m L和1.25mg/m L,RT-q PCR检测0.625mg/m L和1.25mg/m L的中药对肝纤维化相关指标α-SMA、Collagen I、Timp-1 m RNA表达的影响,显示1.25mg/m L的中药对肝纤维化的抑制效果最好,最终选用1.25mg/m L的中药进行机制研究。Western Blot结果显示,TGF-β1处理后,肝纤维化相关蛋白α-SMA、Collagen I、Desmin、Timp-1的表达均显著上升,中药干预后四个相关蛋白的表达与TGF-β1组相比均显著降低。进而检测中药对Hippo信号通路和AMPK信号通路影响,结果显示,与对照组相比,模型组（TGF-β1处理组）p-YAP和p-TAZ的表达量均显著降低,与模型组相比,中药组p-YAP和p-TAZ的表达量均显著增加。与对照组相比,模型组（TGF-β1处理组）p-AMPK的表达量均显著降低,与模型组相比,中药组p-AMPK的表达量均显著增加。结论:1.HLD肝硬化患者糖脂代谢均存在异常情况。2.HLD肝硬化患者的Hippo信号通路被激活,导致YAP蛋白去磷酸化,从而抑制SREBP-1的表达,促进SREBP-2的表达、脂肪酸和胆固醇合成及肝纤维化的进展。3.HLD肝硬化患者的AMPK信号通路被激活,导致其磷酸化,可能导致糖原合成增加,使糖原累积,促进肝纤维化的进展。4.健脾活血中药能够改善肝纤维化程度,其作用机制可能通过促进YAP蛋白磷酸化,抑制Hippo信号通路的活性,抑制脂肪酸和胆固醇合成,进而改善肝纤维化的程度。5.调控脂代谢的Hippo通路和糖代谢的AMPK通路与经典的四个肝纤维化指标（α-SMA、Timp-1、Desmin、Collagen I）存在内在关联。健脾活血中药可能通过调控Hippo通路影响脂代谢相关转录因子SREBP参与肝纤维化进程,还能通过干预经典的四个肝纤维化指标而发挥作用。表明健脾活血中药可发挥传统中药的多环节多靶点药理学作用。