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梨(Pyrus L.)是蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)落叶果树,在冬季具有芽休眠的特性,需要积累一定低温量才能解除休眠。GA是解除花芽休眠、促进花芽萌发的重要物质,其信号转导通路中的关键调控因子DELLA蛋白与GA含量的变化密切相关。砂梨作为福建省的主栽梨品种,为福建梨产业的发展带来了经济效益,探究其花芽休眠过程的相关分子机制,对福建短低温梨和南方梨产业的发展具有至关重要的意义。本试验以‘蜜雪梨’和‘黄花梨’为试验材料,分析不同需冷量砂梨品种花芽休眠期间DELLA基因的表达情况,对其关键DELLA基因进行功能分析,主要结果如下:1.通过PCR扩增技术成功从‘蜜雪梨’和‘黄花梨’中分别扩增获得5条相关的DELLA蛋白编码基因:RpGAI1、PpGAI2、PpGAI3、PpRGL1和PpRGL2,10条DELLA基因的ORF全长均已成功登录到GenBank。两个梨品种PpGAI1、PpGAI2、PpGAI3、PpRGL1和PpRGL2的氨基酸序列相似度分别为99.48%、100%、99.27%、99.17%和99.44%,各DELLA基因在蔷薇科中是高度保守的基因。进化树分析结果显示,‘蜜雪梨’和‘黄花梨’的DELLA基因优先聚类,与白梨、苹果、杜梨等有较近的亲缘关系。相关生物信息学分析表明,各基因编码蛋白在‘蜜雪梨’和‘黄花梨’中的理化性质相似,均属于GRAS超基因家族,其亚细胞定位预测其功能场所位于细胞质、细胞核、线粒体等。2.利用实时荧光定量PCR技术分别测定‘蜜雪梨’和‘黄花梨’花芽自然休眠过程和喷施外源GA处理后DELLA基因的特异表达情况。自然休眠过程表达结果显示,‘蜜雪梨’和‘黄花梨’的DELLA基因的表达量不断发生变化,在每个休眠状态转换时期均出现特异表达;不同砂梨品种DELLA基因表达模式存在差异,‘蜜雪梨’DELLA基因在自然休眠解除临界期达到最大表达峰值,而‘黄花梨’DELLA基因则在花芽萌动期达到最大表达峰值;说明DELLA基因在整个花芽休眠进程中具有相关的休眠解除作用,但在不同品种砂梨的作用不完全相同。喷施外源GA处理表达结果显示,‘蜜雪梨’和‘黄花梨’分别处理14天和28天后解除自然休眠,各试验组在自然休眠解除临界期均呈现表达量上升趋势,且表达量均显著高于对照组,说明GA通过作用于DELLA蛋白来促进休眠解除。3.采用PCR扩增技术成功分离得到‘蜜雪梨’PpGAI1mx、PpGAI2mx和‘黄花梨’PpGAI1hh、PpRGL1hh共4条DELLA基因的启动子序列。启动子软件预测结果显示,各DELLA基因的启动子序列均含有常规启动子核心元件、光调控相关顺式元件以及植物激素应激相关顺式元件等。同个DELLA基因启动子在不同梨品种中的顺式作用元件大部分相同,而不同DELLA基因启动子在相同梨品种中的顺式作用元件组成有所不同。在DELLA基因的启动子区域还含有低温、干旱、创伤及厌氧等逆境胁迫应答元件,说明‘蜜雪梨’和‘黄花梨’DELLA基因参与了激素响应、冷胁迫、干旱胁迫、热应激等多种逆境应激反应,从而调控花芽休眠进程。4.试验构建了 5个含有GFP的DELL4-pCAMBIA1302融合表达载体,利用农杆菌侵染洋葱内表皮细胞,对‘蜜雪梨’5个DELLA蛋白进行亚细胞定位。激光共聚焦显微镜观察结果显示,PpGAI1mx主要定位细胞核和细胞膜周边区域,PpGAI2mx和PpRGL2mx定位于细胞核、细胞质和细胞膜;PpGAI3mx主要定位于细胞核和细胞质;PpRGL1mx定位于细胞质、细胞核、液泡。各DELLA蛋白在细胞核中均有表达,从而推测梨DELLA蛋白具有细胞核定位功能。5.采用原核表达体系表达梨花芽休眠时期‘蜜雪梨’PpGAI3mx蛋白。将所分离的PpGAI3mx基因构建到pEASY-Blunt E1表达载体中,转化BL21(DE3)宿主菌后成功获得pEASY-Blunt E1-PpGAI3mx重组蛋白表达菌株。经IPTG诱导表达后,对各抽提液进行SDS-PAGE和Western blotting检测,成功诱导出蛋白分子质量约60kDa的目的蛋白。说明梨DELLA蛋白能与His标签蛋白形成融合蛋白,并在37℃诱导系统中正确表达,且该融合蛋白可溶于水,但其大部分以不溶性包涵体形式存在。6.利用农杆菌介导的叶盘法将已构建的PpGAI3mx-pCAMBIA1302表达载体转化普通烟草,经预培养、共培养、筛选培养、生根培养等过程,炼苗后移栽至无菌土中进行室外培养。分子鉴定检测出6株转基因抗性烟草植株,观察发现过量表达PpGAI3mx基因的转基因植株出现叶盘有所减小,节间较短,株高更为矮小等GA缺失型现象,说明DELLA蛋白在梨的生长发育过程中起到负调控GA信号的作用,从而影响着梨花芽休眠进程。本论文首次分离出‘蜜雪梨’和‘黄花梨’DELLA蛋白相关编码基因,探索其在梨花芽休眠过程中的分子机制,进一步揭示了 DELLA蛋白在GA调控梨花芽休眠解除中的作用,为其他多年生落叶果树芽休眠解除的分子机理提供了一定的参考价值。