贝莱斯芽胞杆菌ZJ1对番茄早疫病和灰霉病的作用机制初探及防治效果研究

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本研究对从醉鱼草茎中分离得到的1株对番茄早疫病菌(Alternaria solani)和灰霉病菌(Botrytis cinerea)有良好抑菌活性的内生细菌ZJ1进行了分类地位、生物学特性及抑菌活性的测定,鉴定了其挥发性物质的组成成分,并对其抑菌机制进行初探;筛选了ZJ1菌株油悬浮剂制备的条件,对其制剂进行了质量检测以及防效和促生作用的测定,研究结果为植物内生细菌ZJ1在生物防治方面的应用以及后期的市场化奠定理论基础。具体研究内容如下:1.通过形态学鉴定,辅以16S rDNA与gyrA特异基因对其进行系统发育研究,将醉鱼草内生细菌ZJ1鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus Velezensis)。2.对ZJ1菌株的致死温度和致死酸碱度进行测定,结果表明,ZJ1菌株致死温度为96℃、20 min,致死pH为小于等于4或大于等于14;通过对ZJ1菌株在含不同金属离子的培养基中生物膜形成情况进行观察,测定不同金属离子对其生物膜形成的影响,结果表明,0.3%的Zn2+、Mn2+、Cu2+和Fe2+会抑制ZJ1菌株产生生物膜,但同浓度的Mg2+、K+均可促进ZJ1菌株生物膜的产生,且Mg2+对ZJ1菌株产生生物膜有显著的促进作用;使用96微孔板定量法对ZJ1菌株生物膜形成能力进行了测定,结果发现在含有0.3%Mg SO4的培养液中培养2 d时产生的生物膜最多,且ZJ1菌株为强生物膜形成株。3.采用平板对峙法和平板对扣法对ZJ1菌株及其挥发性物质的室内抑菌活性进行测定,结果表明,ZJ1菌株对A.solani和B.cinerea的抑制率分别为59.15%和71.62%,ZJ1菌株挥发物对A.solani和B.cinerea的抑制率分别为40.58%和50.90%;通过室内盆栽测定ZJ1菌株发酵液对番茄早疫病害和灰霉病害的防效,结果发现,ZJ1菌株发酵液及不同稀释倍数对这2种病害的盆栽防效均在70%以上。4.通过对ZJ1菌株挥发性物质成分进性GC-MS检测,发现其挥发物的主要成分为2-十三烷酮、2-十一酮、1-十三烯、2-壬酮、异辛醇、2-庚酮、2-壬醇、1-二十醇等8种物质,其中异辛醇、2-壬酮、2-壬醇、2-十一酮对A.solani和B.cinerea的抑菌活性较好;使用生长速率法分别测定异辛醇和2-壬醇对A.solani和B.cinerea的毒力,并对2-壬醇和异辛醇不同配比进行筛选及增效系数的测定,结果表明,2-壬醇对A.solani和B.cinerea的毒力较高,EC50分别为1.82μL·m L-1和0.54μL·m L-1,异辛醇对这2种病原菌的EC50分别为7.12μL·m L-1和1.64μL·m L-1,2-壬醇和异辛醇分别以1:1和4:1混配后对A.solani和B.cinerea有增效作用;通过离体防效试验对挥发性物质以及ZJ1菌株对2种病害熏蒸防效进行测定,发现2-壬醇和异辛醇1:1混配浓度为0.0625μL·m L-1时,对A.solani的防效最好,异辛醇浓度为0.25μL·m L-1时,对B.cinerea的防治效果最好,防效可达95.24%,ZJ1菌悬液不同浓度对2种病原真菌的防效在56.67%~81.00%之间。5.对ZJ1菌株产生的抑菌活性物质进行检测,并以A.solani为指示菌,利用扫描电镜观察ZJ1菌株和其挥发物对病原菌菌丝的影响。结果表明,ZJ1菌株可分泌胞外蛋白酶及纤维素酶,但不能产生几丁质酶、β-l,3-葡聚糖酶以及IAA,且不具溶磷能力。通过扫描电镜观察发现ZJ1菌株及其挥发物均会使A.solani菌丝变细、扭曲、畸形、分叉、断裂、菌丝表面变皱且出现裂解,另外挥发性物质还会引起菌丝内溶物流出引起菌丝干瘪。6.经过ZJ1菌株与不同溶剂和助剂的相容性试验,筛选出ZJ1菌株油悬浮剂的最佳配方为:乳化剂7%(v/v)吐温80、抗生素50μg·m L-1两性霉素、防冻剂2%Ca Cl2、润湿剂1%SDS、稳定剂1%Ca CO3、分散剂0.5%木质素磺酸钙、保护剂5%糊精,余量用溶剂花生油补足,并按照国家质量检测标准对其各项指标进行检测,结果表明,5.75亿cfu·m L-1贝莱斯芽胞杆菌ZJ1油悬浮剂各项指标均符合且高于国家标准。7.通过用不同稀释倍数的贝莱斯芽胞杆菌ZJ1油悬浮剂处理温室盆栽番茄,对其防效以及促生作用进行测定,结果表明,5.75亿cfu·m L-1贝莱斯芽胞杆菌ZJ1油悬浮剂200倍稀释液对A.solani和B.cinerea防效最好,且会使茎粗增长率显著增大,但同时使株高增长率显著降低。
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