碱蓬GST基因cDNA的克隆与表达及碱蓬cDNA过量表达文库转化拟南芥的研究

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盐胁迫包括细胞的渗透胁迫和离子胁迫,以及由这两种胁迫而产生的次级胁迫即活性氧胁迫。细胞中积累的大量活性氧能够导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内的抗氧化系统可以分为酶促反应系统和非酶促反应系统,其中酶促反应系统主要包括超氧化物歧化酌(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等。GSTs不仅能催化降解有毒的内源或异源代谢产物,降低这些物质导致的氧化损伤;而且同时具有GPOX活性,能够直接清除细胞内的活性氧。 植物GST的cDNA克隆最早从谷类作物中分离到,后来也相继在大豆、马铃薯、烟草、拟南芥中分离到。在烟草中已鉴定GST基因的过量表达分别有效的增强了其耐受盐胁迫和抗冷冻的能力。 盐地碱蓬(Suaeda Salsa)是一种可以在400mMNaCl的浓度下正常生长的耐海水植物。从盐地碱蓬幼苗的cDNA文库的1000余个ESTs(Expressed Sequence Tags)中获得一个约0.6kb的EST,同源性分析表明该EST与已报告的大豆(Glycine nax)GST cDNA的同源性达55%。上述EST经通用载体引物双向测序获得其全长cDNA产列,GenBank登录号是AF321437。该基因可能编码由235个氨基酸组成的谷胱甘肽转移酶(GST),将其与刊源性较高的4个GST cDNA进行氨基酸同源性比较,表现出较高的保守性。Southern杂文结果证明GST基因在碱蓬基因组中可有至少两个以上的拷贝;Northern杂交结果表明,400mM NaCl处理48h,幼叶中GST mRNA的表达量是对照的2-3倍,说明碱篷中GST基因受盐诱导。 我们建立了一个过量表达碱蓬cDNA文库的系统,用以进行拟南芥的大规模转化。过量表达载体由pCAMBIA1200和pRT105组装而成,使得cDNA文库在CaMV35S启动子作用下过量表达。用cDNA插入子两侧的载体引物进行PCR扩增,结果表明cDNA文库中个少94%的克隆含有cDNA插入子。将过量表达文库的混合质粒经农杆菌介导用花序浸泡法进行拟南芥的遗传转化,在筛选的100.000粒种子中获得500株潮霉素抗性苗,3株表现出特异表型。在T1代k ,仅有20%的转基因植株为单拷贝插入。转基因植株的PCR鉴定呈现阳性,其耐盐性分析正在进行之中。
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