研究背景：血栓性疾病是严重威胁人类健康的疾病之一，也是引起人类死亡的最常见疾病。血小板黏附到受损的血管壁上是血栓形成的第一步，在这一过程中，血管性血友病因子（von willebrand factor, vWF）起关键作用，它在血小板与内皮下基质（主要是各型胶原纤维）的相互黏附中起着桥梁作用，介导血小板粘附于血管损伤部位暴露的内皮下胶原[1,2]。vWF是一种由多个功能结构域组成的多聚糖蛋白，它一方面通过自身的A1区与血小板膜受体GPIb-IX-V复合物结合，另一方面通过其A3区与胶原结合[3-5]。在正常情况下，vWF处于静息状态，并不与血小板发生反应。然而，在病理条件下如在动脉粥样斑块变狭窄部位，vWF通过其A3区与暴露的内皮下胶原纤维结合，在血流剪切力的作用下，vWF随之发生空间构象的变化，使其可以与血小板膜表面糖蛋白GPIbα结合，进而使血小板发生聚集，最终导致血栓形成。因此，vWF-A3区与胶原的结合是启动血小板粘附、聚集并进而导致血栓形成的首要环节[2]。我室曾报道了一株特异性结合vWF-A3区的单克隆抗体（mAb）-SZ125，这株mAb不仅可以有效阻断静止和流体状态下vWF与Ⅲ型胶原的相互作用，而且能抑制瑞斯托霉素或博妥霉素诱导的血小板聚集[6]。该抗体是针对胶原-vWF-GPIb轴来阻止血小板的早期粘附和活化，具有更早、更好的抗栓活性，并减少出血危险性，具有更为广阔的应用前景。为了更深入地了解vWF-A区结构与功能间的关系，有必要对SZ125所结合的具体氨基酸位点做精确的分析。抗原表位的鉴定对于研究整个免疫过程以及抗原本身结构与功能的关系具有重要的意义，用于定位mAb的抗原表位的方法有很多，最常用的就是根据抗原氨基酸序列制备合成肽法。随着电离质谱技术的迅速发展,特别是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术的出现,使得抗原表位研究有了更进一步的发展。与传统方法相比,质谱分析可直接分析抗原表位，具有耗样量少、分析速度快、灵敏度和准确度高等优点。免疫亲和质谱是免疫亲和技术和现代质谱技术的结合,是测定抗原表位的有效方法。这种方法利用特异的蛋白酶将不受保护的抗原水解，只剩下与抗体连接受保护而未发生水解的肽段，然后利用MALDI-MS对该肽段进行研究。因此，应用免疫亲和质谱技术，结合合成肽法和氨基酸定点诱变技术，可以对mAb SZ125所结合的具体氨基酸位点进行精确定位。目的：本研究旨在应用免疫亲和分离与质谱分析技术，结合合成肽法和氨基酸定点诱变技术，确定抗vWF单克隆抗体SZ125的精确氨基酸抗原表位，从而为研究探讨单抗SZ125的抗栓机制提供理论依据，为下一步研究vWF-A区结构与功能之间的关系以及将来开发基于单抗SZ125的抗栓药物奠定基础。方法：（1）首先制备溴化氰活化的琼脂糖珠，并耦联SZ125；将该SZ125-琼脂糖珠与重组的vWF-A3蛋白（rvWF-A3）混合反应后，加入胰蛋白酶酶解rvWF-A3蛋白，产生一系列酶解后的抗原肽段，然后用MALDI-TOF-MS技术对抗原决定簇肽段-SZ125复合物进行分析。（2）人工合成分析得到的氨基酸序列，利用反相高效液相色谱法纯化合成肽，并利用MALDI-TOF-MS技术对其纯度和性质进行分析，同时用ELISA方法验证其与SZ125的结合能力。（3）应用氨基酸定点诱变技术，选择分析得到的氨基酸序列内抗原性较强且暴露于vWF-A3区蛋白表面的氨基酸位点进行单点突变，诱变后的表达质粒转化大肠杆菌并诱导表达，然后用Western Blot、ELISA方法验证vWF-A3突变蛋白与SZ125的免疫结合能力，同时利用ELISA方法分析各突变蛋白与胶原的结合能力。结果：用MALDI-TOF-MS技术分析抗原决定簇肽段-SZ125复合物，证实与SZ125结合部位即连续表位的肽段为¹⁰⁰¹EGGPSQIGDALGFAVR¹⁰¹⁶。初步将SZ125的抗原表位定位在¹⁰⁰¹EGGPSQIGDALGFAVR¹⁰¹⁶。免疫分析证实，合成肽段NH2-EGGPSQIGDALGFAVR-COOH剂量依赖性地与SZ125结合，但结合程度低于其与rvWF-A3的结合。再次证明了SZ125的抗原表位位于¹⁰⁰¹EGGPSQIGDALGFAVR¹⁰¹⁶。通过氨基酸定点诱变技术，在原核表达系统成功获得vWF-A3突变蛋白，表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在。经过变性和复性后,获得具有生物活性的突变蛋白。通过分析与SZ125、Ⅲ型胶原结合能力得到决定抗原-抗体结合的关键氨基酸为E¹⁰⁰¹、F1013、V1015、R¹⁰¹⁶，且这四个氨基酸位点对于SZ125阻断vWF与Ⅲ型胶原的相互作用具有重要意义。结论：（1）运用免疫亲和质谱技术确定抗vWF-A3区单抗SZ125在vWF-A3区的抗原表位位于¹⁰⁰¹EGGPSQIGD ALGFAVR¹⁰¹⁶.（2）利用氨基酸定点突变技术，确定vWF-A3区上的E¹⁰⁰¹、F1013、V1015、R¹⁰¹⁶这四个氨基酸位点起关键作用。它们是vWF-A3区与SZ125结合的关键氨基酸，同时也是vWF-A3区与Ⅲ型胶原结合的关键位点（3）单抗SZ-125通过这四个氨基酸位点与vWF-A3结合发挥抗栓作用，我们推测这四个氨基酸位点在空间构像上调控vWF-A1区与GPIbα结合。当单抗SZ-125与vWF-A3区的E¹⁰⁰¹、F1013、V1015、R¹⁰¹⁶结合后，增加了vWF-A3与vWF-A1的结合，从而使得A1区与GPIbα的结合位点不能暴露出来，进而阻止了A1与GPIbα的结合。本研究结果为下一步研究vWF-A区结构与功能之间的关系以及将来开发基于单抗SZ125的抗栓药物奠定基础。