背景及目的：特发性肺纤维化(IPF)病理早期表现为肺泡炎，晚期成纤维细胞转化为表达平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)的肌成纤维细胞，细胞外基质(ECM)过度沉积。减少肺间质内ECM沉积，促进其降解是IPF治疗的关键环节。降解细胞外基质的两种主要酶类是纤溶酶和基质金属蛋白酶(MMP)。纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activatorinhibitor-1，PAI-1)通过灭活尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及组织型纤溶酶原激活物(tPA)，抑制纤溶酶形成和MMP活性，促进ECM沉积和肺纤维化的发展。近年研究表明，PAI-1可能作为独立因素促进器官纤维化的发生、发展，如：过表达PAI-1可能加重正常皮肤和瘢痕皮肤成纤维细胞胶原沉积；PAI-1-/-的小鼠博莱霉素诱导的肺纤维化程度减轻。因此，我们设想通过下调肺纤维化过程中PAI-1的表达达到治疗肺纤维化的目的，并初步探讨其发挥作用的信号途径。　　 RNAi的发现是生物界的一场革命，siRNA技术是以转录后调节为目的的新型基因调控技术，通过合成特异性小分子RNA抑制靶基因的表达，已作为基因功能研究和基因治疗的全新手段。　　 本研究中，我们首先在体外观察上调或下调PAI-1表达对成纤维细胞增殖的影响，然后应用PAI-1siRNA治疗博来霉素诱导的肺纤维化，以期为临床肺纤维化的治疗提供新的分子靶点。　　 方法：　　 1.建立大鼠成纤维细胞低表达及过表达PAI-1的细胞模型　　 1.1 体外分离培养原代大鼠胚肺成纤维细胞，免疫组化法检测波形蛋白及α-SMA进行鉴定。　　 1.2 筛选PAI-1siRNA有效序列　　 参考文献，合成针对PAI-1 mRNA的3对siRNA序列，分别为219siRNA片段，559siRNA片段和1061siRNA片段。应用脂质体法瞬时转染成纤维细胞，以非特异性(NC)siRNA为阴性对照，采用Real time RT-PCR及Western blot法从基因水平及蛋白水平分别检测三对siRNA分子的沉默效率，筛选出针对PAI-1 mRNA高效的siRNA片段。　　 1.3 为了应用含PAI-1基因的真核表达质粒PCDNA-PAI-1转染成纤维细胞，载体PCDNA3.1作为阴性对照，Real time RT-PCR法观察24小时PAI-1mRNA的表达，Western blot法观察48、72小时PAI-1蛋白的表达。　　 2.PAI-1对成纤维细胞增殖、转化、胶原合成、Ca2+浓度的影响及其机制　　 细胞分为Normal组、NC组、559siRNA组、PCDNA3.1组、PCDNA-PAI-1组，MTT法检测细胞24小时，48小时，72小时增殖效果；激光共聚焦显微镜观察48、72小时细胞内游离Ca2+浓度的变化；细胞分为Normal组、NC组、559 siRNA组以及Normal组、PCDNA3.1组、PCDNA-PAI-1组，Real time RT-PCR法分别测定24小时α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达；Western blot法分别测定48、72小时ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达。　　 3.559 siRNA对BLM诱导大鼠肺纤维化的治疗作用及其信号通路　　 130-140克Wistar健康雄性大鼠72只，分成4组，Sham组、BLM(B)组、BLM+559 siRNA组(B+P组)和BLM+非特异(NC) siRNA组(B+N组)。首先按5mg/kg气管内注入BLM制作肺纤维化模型，Sham组注入0.2mL生理盐水。造模后，每周两次气管内给药：B+P组注入DEPC水溶解的559siRNA7.5nmol(0.2mL)；B+N组注入相同剂量的NC siRNA;Sham组和B组注入0.2ml生理盐水。于第7、14、28天各组分别处死6只：Real time RT-PCR及Western blot法测定每个时间点PAI-1基因水平及蛋白水平的敲除效率；观察治疗后组织学(HE染色)变化；Real timeRT-PCR、Western blot及免疫组化法测定α-SMA表达的变化；通过Masson染色及羟脯氨酸含量的测定观察559 siRNA对胶原产生的影响，Real timeRT-PCR及免疫组化法进一步分析Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达，了解559siRNA对不同胶原类型的影响；Western blot法测定不同时间点ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达，了解559 siRNA发挥作用的信号通路。　　 4.统计学处理　　 采用SAS8.0软件进行统计学分析，计量资料以(?)±S表示。观察组与对照组的样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1.成功建立低表达及过表达PAI-1的细胞模型　　 1.1 免疫组化法检测到培养细胞波形蛋白表达阳性，α-SMA表达阴性，鉴定为成纤维细胞，选取2-4代细胞进行试验。　　 1.2 分子生物学方法筛选出siRNA有效序列　　 转染559 siRNA24小时后，Real time RT-PCR结果显示，PAI-1 mRNA表达下调70±7％，Western blot结果显示，48、72小时PAI-1蛋白表达分别下调73.5±10％、42±3％;转染219 siRNA后，PAI-1 mRNA下调25±13％，蛋白表达分别下调47±20％、29.3±1％。1061 siRNA对PAI-1基因及蛋白表达均无影响。我们认为，559 siRNA对PAI-1表达有较好的抑制效果。　　 1.3 成功建立过表达PAI-172小时以上的成纤维细胞　　 PCDNA-PAI-1转染成纤维细胞后，Real time RT-PCR法24小时PAI-1mRNA表达上调1818±6.10％(P＜0.01)，48、72小时蛋白表达分别上调280.6±49％、306.6±32.4％(P＜0.01)。　　 2.过表达或阻断PAI-1表达对成纤维细胞增殖、转化、胶原合成及Ca2+浓度的影响及其机制　　 2.1 MTT结果显示，转染559 siRNA后，细胞增殖明显低于NC组(P＜0.01)，以48小时作用最明显，72小时作用有所减弱。转染PCDNA-PAI-1后，细胞增殖率明显增加，作用可持续72小时（P＜0.01）。　　 2.2 共聚焦显微镜观察正常培养的大鼠胚肺成纤维细胞内有一定浓度的Ca2+，转染559 siRNA后，Ca2+浓度下降，转染PCDNA-PAI-1后，Ca2+浓度持续上升，与对照组比较均有明显统计学差异(P＜0.05)。　　 2.3 Real time RT- PCR结果显示：阻断或过表达PAI-1表达，成纤维细胞中α-SMA及Ⅰ型胶原的mRNA表达水平明显减低或增加(P＜0.05)；而改变PAI-1表达对Ⅲ型胶原的mRNA无影响（P＞0.05）。　　 2.4 Western blot结果显示，改变PAI-1表达，对非磷酸化状态的AKT、ERK信号途径没有影响，而阻断或过表达PAI-1，可以明显下调或上调p-AKT、p-ERK的水平(P＜0.01)，PAI-1可能是通过活化AKT、ERK信号途径发挥促进成纤维细胞增殖、转化的作用。　　 3.559 siRNA对肺纤维化的治疗作用　　 3.1 559 siRNA在动物水平的敲除效率　　 气管内滴入559 siRNA后，7天、14天、28天PAI-1 mRNA水平分别下调29±9％、58±9％、67±7％，蛋白表达分别下调46±11％、51.9±5.3％、65.5±4％。通过免疫组化观察到，治疗后各时间点成纤维细胞胞浆中PAI-1表达明显减少(P＜0.01)，我们认为，559 siRNA可以成功下调肺组织PAI-1的表达。　　 3.2 组织学变化　　 HE染色观察到B组、B+N组第7天肺泡腔及间质内可见大量炎性细胞浸润，随着时间延长，肺泡间隔明显增厚。B+P组各时间点肺泡炎及肺泡结构破坏明显减轻。　　 3.3 559 siRNA对肺组织成纤维细胞转化的影响　　 Real time RT-PCR及Western blot结果显示，7天、14天、28天B+P组肺组织α-SMA mRNA及蛋白表达均明显下调，与B+N组有明显统计学差异(P＜0.01)，免疫组化结果显示，治疗后肺组织α-SMA在胞膜及胞浆中的表达明显减少。　　 3.4 559 siRNA对肺组织胶原表达的影响　　 3.4.1 Masson染色观察到模型组7天时无明显胶原产生，14天有小灶性胶原形成；28天间质内可见大量胶原纤维呈束状或片状沉积，形成明显纤维化。通过图像分析积分光密度总和得出，B+P组在14天及28天纤维化明显减轻，（P＜0.05）。　　 3.4.2 肺组织匀浆中羟脯氨酸含量的测定　　 肺组织匀浆中，7天时羟脯氨酸的含量不升高，从14天开始到28天各组羟脯氨酸的含量持续升高，B+P组羟脯氨酸含量与B+N组比较明显减低(P＜0.01)。　　 3.4.3 559 siRNA对Ⅰ型胶原表达的影响　　 559 siRNA对Ⅰ型胶原mRNA的抑制作用主要表现在7天、14天，28天抑制作用减弱。免疫组化显示治疗后各时间点Ⅰ型胶原在成纤维细胞和肺间质内表达明显减低，与NC组比较均有明显统计学差异(P＜0.01)　　 3.4.4 559 siRNA对Ⅲ型胶原表达的影响　　 Real time RT-PCR及免疫组化结果显示559 siRNA对Ⅲ型胶原的抑制作用主要表现在病理过程的晚期，7天时抑制作用不明显，随着肺纤维化　　 3.4.5 Western blot测定ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达：结果显示，治疗7天、14天、28天后，p-AKT、p-ERK的表达明显下调，与B+N组有明显统计学差异（P＜0.05），而ERK、AKT表达没有变化，与细胞试验结果一致。　　 结论：　　 1.从体外试验得出，559 siRNA及PCDNA-PAI-1可以成功高效转染进入原代大鼠胚肺成纤维细胞，从而使PAI-1表达下调或上调72小时以上；下调PAI-1表达可以抑制成纤维细胞转化、增殖、胶原合成，降低细胞内Ca2+浓度，使磷酸化AKT、ERK表达下调；上调PAI-1表达可以促进成纤维细胞转化、增殖、胶原合成，增加Ca2+浓度，活化AKT、ERK信号途径。　　 2.从动物试验得出，在肺纤维化过程中，PAI-1表达上调，PAI-1559 siRNA可以下调其表达；559 siRNA可以减少肺组织胶原的合成、促进ECM降解，阻滞肺纤维化的发展；559 siRNA下调PAI-1表达后，可能通过下调肺组织成纤维细胞内磷酸化ERK、AKT的表达水平发挥治疗肺纤维化的作用。