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目的：
RNA干扰近年来已被广泛应用于肿瘤基因功能和基因治疗的研究领域，然而几乎所有肿瘤细胞不是单一基因控制的，而且许多恶性肿瘤细胞具有显著的遗传异质性和表型变异性，提示传统靶向单个基因沉默技术并不能从根本上根除肿瘤。shRNA共表达可以同时抑制多个基因或同一基因多个靶点的表达，目前已被众多研究者关注[1]。本课题选择与肿瘤凋亡密切相关的Bcl-2和Survivin两个基因，通过构建shRNA串联表达载体转染人宫颈癌Hela细胞，体内、外观察同时沉默Bcl-2和Survivin基因的表达对人宫颈癌Hela细胞生长的影响，并通过与单独沉默单个基因比较探讨双基因共沉默的优势，为宫颈癌的多基因治疗奠定实验基础。
方法：
①根据Bcl-2、Survivin的cDNA序列分别设计构建Bcl-2 shRNA重组质粒pGenesil1.2-Bcl-2，Survivin shRNA重组质粒pGenesil1.1-Survivin及阴性对照重组质粒pGenesil1.l-HK。②由Bcl-2、Survivin重组质粒构建双基因串联shRNA质粒表达载体pGenesil1.1+2-(Bcl-2+Survivin)。③实验分为五组：Bcl组，转染重组质粒pGenesil1.2-Bcl-2; Sur组，转染重组质粒pGenesil1.1-Survivin; Bcl+Sur组，转染重组质粒pGenesil1.1+2-(Bcl-2+Survivin); Neg组，转染阴性对照质粒pGenesil1.1-HK;Blank组，未转染空白对照组，分别进行体内外实验。④瞬时转染24h、48h、72h时，RT-PCR测定各组Bcl-2和Survivin mRNA表达；Hoechst33258染色和FCM检测瞬时转染48h细胞周期和凋亡情况；⑤G418筛选获得稳定转染Hela细胞，RT-PCR测定稳定转染Bcl-2、Survivin mRNA表达，FCM和Western-blotting检测稳定转染细胞Bcl-2和Survivin蛋白表达；MTT检测各稳定转染组细胞增殖能力及对顺铂刺激的敏感性；⑥稳定转染Hela细胞接种BALB/c裸鼠，观测各组成瘤时间、瘤体积和瘤重量的变化，免疫组化测定Bcl-2和Survivin蛋白表达。
结果：
①酶切和测序结果表明成功构建shRNA重组质粒表达载体pGenesil1.2-Bcl-2、pGenesil1.1-Survivin、pGenesil1.1-HK；②酶切鉴定结果显示双基因shRNA串联质粒表达载体pGenesil1.1+2-(Bcl-2+Survivin)构建成功；③各重组质粒表达载体转染Hela细胞，瞬时转染24h、48h、72h RT-PCR结果显示，三个时间点单独沉默或共沉默组均能有效抑制相应基因mRNA表达，以48h抑制效果最显著，联合沉默Bcl+Sur组在瞬时转染48h对Bcl-2 mRNA和Survivin mRNA表达抑制率分别为85.71％和60.56%，均显著高于转染单基因shRNA的Bcl组和Sur组(P＜0.05)。④瞬时转染48h时，Hoechest33258染色检测，Bcl+Sur组的凋亡率(17.95±0.45)%显著高于Bcl组（9.57±034）%(P＜0.05)和Sur组(13.04±0.16)%(P＜0.05); FCM检测PI染色后细胞周期变化，显示Bcl+Sur组凋亡率较Bcl组和Sur组均显著升高(P＜0.05)；⑤G418成功筛选各重组质粒稳定转染的Hela细胞，FCM检测各组转染效率均达80%以上；RT-PCR显示稳定转染Bcl+Sur组对Hela细胞Bcl-2和Survivin mRNA表达的抑制率分别为76.11%和81.33%; FCM测得Bcl+Sur组对Bcl-2和Survivin蛋白的表达抑制率分别为48.01%和51.64%，与单基因shRNA沉默组比较均具有显著差异(P＜0.05)，Western-blotting检测结果与FCM结果基本相符；⑥MTT检测Bcl+Sur组稳定转染细胞的增殖能力明显抑制，对顺铂刺激的敏感性显著提高（与Bcl和Sur组比较，P＜0.05）。⑦体内实验结果显示Bcl+Sur组移植瘤较单基因沉默组的平均成瘤时间延迟，平均瘤体积、重量明显下降(P＜0.05)，切片的免疫组化结果进一步证实Bcl+Sur组Hela细胞Bcl-2和Survivin两种蛋白表达均明显下调。
结论：
shRNA串联重组质粒表达载体pGenesil1.1+2-(Bcl-2+Survivin)转染人宫颈癌Hela细胞后，可同时降低Bcl-2和Survivin mRNA与蛋白表达，比单独沉默Bcl-2或Survivin基因能更好地促进Hela细胞凋亡，抑制细胞增殖，提高化疗药物的敏感性。