黑曲霉(Aspergillus niger)是丝状真菌中最常见菌种,因为其具有优良的产酶产酸功能,被广泛的应用于工业生产中。ras基因属于小G蛋白家族中Ras家族成员,在GTPase蛋白信号途径中发挥重要作用,Ras家族对细胞的增殖、分化、细胞凋亡和基因调控都很重要。目前,真菌中ras基因的报导较少,黑曲霉中ras基因的功能尚不明确。因此,通过分子生物学的手段,对黑曲霉中ras基因进行功能分析,对探讨GTPase蛋白信号途径中关键基因如何调控真菌生长发育及代谢产物具有重要意义。本研究通过RAN干扰(RNAi)技术,沉默黑曲霉3.316菌种中的ras基因,对转化子沉默效率进行分析,进一步探究该基因对菌丝生长发育的影响,初步分析ras基因在黑曲霉生长及代谢中的作用。首先,用软件预测ras基因的保守区域,根据保守区域设计引物。以已公布全基因组序列的黑曲霉CBS513.88为模板设计两对引物,以黑曲霉3.316为模板,克隆出长度分别为629bp和379bp的Lras、Sras基因片段,在片段两段加上合适的酶切位点,与pSilent-1质粒共同经过两步双酶切连接,成功构建S-pS-ras和L-pS-ras两个沉默质粒。利用PEG介导的原生质体转化法和电击转化法,通过潮霉素B抗性平板的筛选得到9株抗性菌株,经过目的基因检测,成功得到4株转化子。最后,对转化子特性进行了研究。(1)通过RT-PCR对转化子进行了沉默效率分析,结果显示,两株转化子ras基因均有所下调,分别下调了67.4%和64.7%。(2)对转化子进行了菌丝生长速度测定、产孢状况观测和生物量测定。野生型菌丝生长速度分别为两株转化子的1.23和1.17倍;同期培养的野生型黑曲霉和沉默转化子,野生型产孢比转化子早,显微观察转化子菌丝相比野生型细,菌丝分支明显减少;野生型黑曲霉生物量分别是两株转化子的1.88和1.82倍。(3)通过液体发酵实验,测定了转化子β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶(Cx)酶活和总酸的产量,结果显示,转化子对比野生型黑曲霉,酶活和总酸产量均有所下降。本文研究结果初步说明,ras基因可能通过调控信号通路下游相关基因,进而调控纤维素酶及酸的分泌过程,该基因的沉默对黑曲霉生长以及代谢均有抑制作用。